PCR i molekylærbiologi Flashcards
hvordan fungerer kokelysering?
tilsetter dna eller rna materiale i et rør. så tilsettes
det en lyseringsbuffer som bryter ned eventuelle proteinkapper, ekstra celle
membran for de organismene som har det. derettes kokes det i 95 grader for å bryte ned
cellemembranen å få dna tråden ut. sentrifugeres så supernatanten inneholder
dna/rna som videre kan brukes
hvordan fungerer dna/rna ekstrasjon med magnetiske kuler?
Lyserer prøven. Lysering er viktig for å bryte
ned nukleaser da de kan interferer med prøven (siden nukleaser fosforbindinger i dna/rna).
Man kan bruke proteinase k som lyserer celler
og bryter ned nukleaser. Paramagnetiske kuler
blandes sammen og bindere seg til dna og rna. viktig at
bufferen som magneten er i fører til kutt av hydrogenbindingen
mellom vann og dna slik at kulene kan binde seg til den. Tar en magnet
og fjerner resten av væsken, tilsetter en elueringbuffer som slipper dna
fra magneter og dermed kan den ekstraheres.
hva er forskjellen på konvensjonell og real time PCR?
ved konvensjonell PCR må man etter tilsettelse av primer og buffer
ha et ekstra trinn slik at vi blir istand til å se resultatet,
altså om primeren faktisk har bundet seg til noe eller ikke, gjøres vanligvis med
protein eller kapilær elektrofosese.
i real time pcr kan man få resultate av pcr i sanntid mens reaksjonene foregår og dermed
ikke trenger et ekstra synligjøringstrinn.
hva gjør en probe i pcr, bruk SYBR Green som et eksempel?
proben vil avgi et signal som kan leses og fortelle oss hvor mye som blir dannet
av produktet.
eks:
* Denaturering: DNA enkeltrådig
- SYBR Green vil ikke binde seg
- Fluorescenssignalene vil være lave
* Annealing: Primerene bindes til målsekvensen
- SYBR Green binder seg til små biter av dobbeltrådig DNA
- Fluorescensen øker
* Elongering: Polymerasen lager dobbeltrådig DNA
- SYBR Green binder seg
- Måling foregår i slutten av elongeringsfasen
* 530 nm
* For hver syklus vil mengden dobbelttrådig DNA øke
- Økende fluorescens.
hva er fordelen med å bruke FRET istedet for SYBR Green?
ved fret brukes det 2 prober som skal ligge ganske nærme hverandre
på dna tråden. når den ene proben lyses på vil den fluoriscere og energien vil videre
føres til proben vedsiden av. denne vil så gi ut en farge som detekteres.
vi bruker 2 prober som gjør at det er veldig spesifikt, da et svar på den her vil tyde
på at de er vedsiden av hverandre og at det vi har funnet er riktig gen. SYBR Green er ikke like spesifikt
da den kan binde seg hvor som helst på dna og i et hvilket som helst
dna tråd, så lenge den er nylig syntetisert
hvordan fungerer en TaqMan probe?
Når proben er fritt vil den ikke avgi
signal, men når den binder seg og polymerasen
kløyver den vil den avgi signal. Vil ikke avgi signal
når bundet til vev siden quencher som sitter rett
vedsiden av den, stopper alle signaler den kan gi
hva er en CT-verdi?
Ct verdi er hvor mange sykluser som trengs
for å få en eksponentiell vekst. Det
er sykluse som kommer akuratt når kurven
har nådd over terskelverdien
hva er terskelverdien i PCR?
- Threshold:
- Terskel som definerer når signalstyrken blir signifikant forskjellig fra
bakgrunnsignalet. - Denne settes automatisk eller manuelt i den tidlig eksponentielle
fasen, der kurven viser en dobling i mengde PCR-produkt.
hvis man har mye dna i prøven, hvordan vil ct verdien være?
Jo mer dna jo fortere får man en eksponentiell vekst, så har man en prøve der man har eks mye virus vil man få lite ct verdi
hva er en primer dimer og Hairpin dimer?
det er to primere som har bundet seg sammen
Hairpin dimer er en dimer som har festet seg på seg selv
hva bør man tenke på når man designer en primer?
Primerlengde på 18-30 nukleotider er best
Smeltetemperaturen (Tm) mellom 65 °C og 75 °C, og innenfor 5 °C fra hverandre.
GC-innholdet skal være mellom 40 og 60%, hvor 3 ‘enden slutter på C eller G for å fremme binding.
Prøv å unngå regioner med sekundær struktur, og ha en balansert fordeling av GC-rike og AT-rike domener.
Prøv å unngå løp på 4 eller flere av en base, eller dinukleotidrepetisjoner (for eksempel ACCCC eller ATATATAT).
Unngå intraprimer homologi (mer enn 3 baser som utfyller i primeren) eller interprimer homologi (fremover og
bakover primere som har komplementære sekvenser). Disse omstendighetene kan føre til selv-dimers/ hairpin dimers eller primerdimers
i stedet for annealing til de ønskede DNA-sekvensene.
hvordan kan man bestemme spesifisitet og sensitivitet i pcr?
Spesifisitet så må det kunne ligne på det som
faktisk er sant. Eks at man finne turberkolose og ikke reagerer med e.coli.
sensitivitet: Måle med lave konsentrasjoner for å se hvor man ikke lenger kan måle genet lenger.
Kan bruke 10 folds fortynning
hvordan påvirker disse parameterne for PCR analysene
* Annealingtemperatur
* Primerkonsentrasjon
* PCR-program
* tid for de ulike stegene
* Antall sykler
* MgCl
* UNG (uracil-DNA glycosylase)
- Annealingtemperatur: Primer binder seg i annealing temperatur,
burde være mellom 50 og 68 grader. Setter prøven i forskjellige temperatur
for å se resultater. Er den lav vil den binde seg uspesifikk er den høy vil
den smelte og ikke binde seg - Primerkonsentrasjon: For høy konsentrasjon vil den lettere binde uspesifikk og den kan også binde seg til hverandre (primer dimer)
Lav kos vil føre til at primer brukes opp og man kan ikke få nok dna - PCR-program: Man burde ha nok sykluser for å få en eksponentiell vekst.
Trenger også nok tid på hvert steg for å binde seg. - MgCl: viktig kofaktor for at polymerase skal fungere
får uspesifikke bindinger ved høye nivåer av Mg så må ha riktig kons
for å unngå dette og blant annet primer dimer. vanligvis en kons på 2mM som er best - UNG (uracil-DNA glycosylase): forhindrer kontaminering og degraderer uspesifikke bindinger
da disse har fått en Urasil istede for tymin og stoffet fjerner alle forbindelser som har
en U i koden.
hva er fordelen med å bruke multiplex enn vanlig real time pcr?
- Detektere flere målgen i samme analyse
- Prober med ulik flourefor kan skille mellom forskjellige produkter
hvordan fungerer kvalitetssikringen i pcr?
Internkontroll brukes for hele analyseforløpe. Sjekke om alt fungerer som det skal. Negativ kontroll (vann)
er for å se etter forurensinger, er den positiv tyder det på kontaminering.
Positiv kontroll er en eluat fra en positiv prøve. Brukes for å se at ting går som den skal
Ringtester ved man ikke vet hva svaret er men er en ekstern kontroll for å se at laboratorier finner det de skal.
Noen steder er det ikke internkontroll så man bruker humant dna pcr fra en person, vanligvis fra hals. Hvis denne
ikke blir positiv vil det si at det er et problem i ekstraksjonen av dna
