metagenomikk

Question 1

hva er taksonomi?

Answer 1

Karakterisering, klassifisering
og navnsetting av biologiske
grupper

Question 2

hvordan kan man identifisere en art?

Answer 2

DNA-DNA-hybridisering:
~ 70 %
* average nucleotide identity
(ANI): 94-96 %
* 16S rRNA identitet:
~ 98,7 %

Question 3

hva er et metagenom?

Answer 3

Alt genetisk materiale (DNA/RNA) som er
tilstede i en miljøprøve eller klinisk
prøve og som utgjør genomene fra alle de
individuelle organismene tilstede

Question 4

hva er metagenomikk?

Answer 4

Uthenting av genetisk informasjon
vha. genomsekvensering fra et
(metagenomisk) prøvemateriale
uten isolering og kultivering

Question 5

hva er diagnostitsk metagenomikk?

Answer 5

Deteksjon og
identifikasjon av (alle)
patogene mikrober
direkte i et klinisk
materiale ved hjelp av
shotgun-sekvensering

Question 6

hvilke strategier brukes for å utføre metagenomikk?

Answer 6

 Sekvensering av 16S rRNA-gener
 Shotgunsekvensering

Question 7

forklar kort 16s rRNA sekvensering

Answer 7

celler i en prøve blir lysert slik at vi kan få ut dna.
primere som er spesifikke for 16s genet til spesifikke bakterier binder seg til dette området og starter amplifisering. 16s har bevarte og spesifikke områder, det er vha de spesifikke områdene vi kan finne ut av hvilke bakterie slekt det er (genus nivå). den bevarte delen sørger for at vi vil binde oss til alle bakterier som kan være i prøven slik at ingenting blir utelatt. deretter kommer NSG sekvensering, vanligvis illumina sekvensering (avhenge av lab)

Question 8

forklar shotgun sekvensering

Answer 8

så det man baisicaley gjør er å shotgunner (bryter ned dna med restriksjonsenzymer)
til mindre deler som blir kopiert opp. disse delene blir så sekvensert ved at man prøver
å sette dem sammen igjen. når man har klart dette har man
finnet ut av baserekkefølgen til dna biten, vanligvis hele genomet man sekvenserer
sakt på en annen måte:
Imagine taking a page in a book, making hundreds of copies of it, taking those copies and putting them in a paper shredder that magically creates strips of paper that contain various bits and pieces of the original sentences on the starting page. Then imagine reading each of those strips containing the bits and pieces of the sentences, looking for overlapping words and phrases, and eventually being able to reconstruct the entire text on the starting page by having read enough of those shreds of paper. In essence, that is shotgun DNA sequencing. Instead of a page of a book, a scientist starts with a piece of clone DNA or even an entire genome. The DNA is broken apart and many many many many many sequence reads are generated from the DNA pieces. All of those data are analyzed by a computer program that looks for overlapping stretches of sequence and eventually puts that DNA puzzle back together.

Question 9

hva er fordelene med shotgun metagenomikk?

Answer 9

i motsetning til sangersekvensering som kun sekvenserer en liten del av genomet
kan shotgun sekvensering potensielt sekvensere hele genomet (til en mikroorganimse)
* Åpen strategi
– Detektere ukultiverbare mikroorganismer
– Detektere nye mikroorganismer
– Detektere flere enn et agens
* Deteksjon av alle resistens- og virulensgener
* Høy kapasitet

Question 10

hva er ulemper/begrensninger med shotgun metagenomikk?

Answer 10

• Kostbart
• Tilgjengelige genomer bias mot modellorganismer, kjente patogener
  og lett kultiverbare bakterier
• Mye ukjente mikroorganismer – som går under radaren
• «Live and dead»-dilemma, siden den sekvenserer absolutt alt, kan man ikke være sikker på at det man har sekvensert er død eller levende og om den er en del av den aktive bakteriepopulasjonen man leter etter
• Identifisering til stammenivå vanskelig
• Kontaminering
• Validering: studieavhengig
• Datadeling (store mengder data som må handles)

Question 11

hva er fordeler og ulemper med 16S rRNAprofilering?

Answer 11

• Ser på kun et enkelt gen, noe som ikke genererer så mye
  data (lettere å håndtere).
• Metoden er heller ikke så kostbar.
• Vil kun få informasjon om bakterier – og ikke om virus og sopp.
• Oppløsningen på analysen er ofte for lav til at man kan identifisere nært beslektede species.

Question 12

Hvor brukes diagnostisk metagenomikk
idag?

Answer 12

• Infeksjoner i sentralnervesystemet
• Luftveisinfeksjoner
• Ben og leddinfeksjoner
• Blod
• Urin
• Feces
• Antimikrobiell/antiviral terapi
• Nye patogene agens
• Utbrudd/epidemiologi

Question 13

hva er viktige aspekter ved sekvensering?

Answer 13

• Valg av plattform
  – Illumina, IonTorrent, Oxford Nanopore, Pacific Biosciences
• Valg av kit til bibliotekspreparering
  – Med amplifisering: introduksjon av PCR-bias
  – Uten amplifisering: krever høy DNA-mengde
  – Repeats
  – GC-innhold
  – osv

Question 14

hva er Assembly-free taksonomisk profilering og hvilke to metoder har vi hørt om?

Answer 14

 Identifiserer hvilke arter som er tilstede og estimerer mengde
 Utnytter informasjon tilgjengelig i genomer i referansedatabaser

• Markørgener (f.eks. 16S rRNA eller andre husholdningsgener)
  med kjent taksonomi brukes til sammenligning
• Eksempler verktøy: mOTU, MetaPlan

K-mer
* Korte DNA-sekvenser (k-mer) fra prøvematerialet søkes inn
egne k-mer databaser. K-mer i database har kjent taksonomi
og kan derfor brukes til å sette taksonomi på våre ukjente
* Eksempel verktøy: Kraken

Question 15

hva er assembly?

Answer 15

Bioinformatisk prosess der korte
DNA-sekvenser (reads) pusles
sammen til contigs (i et forsøk) for
å lage en sammenstilling av
orginale genomer

Question 16

hva er en contigs?

Answer 16

Et sett med overlappende kloner som sammen inneholder en “sammenhengende” region av et genom kalles en contig – eller i dette tilfellet en klonecontig. Genomsekvensering bruker konseptet en contig, men på en annen måte. For genomsekvensering er ikke delene faktisk fysiske segmenter av DNA, men snarere strekninger av generert DNA-sekvens (ofte kalt en sekvens som er lest). Ved å etablere overlappingene mellom et sett med sekvensavlesninger, kan man etablere en sekvenserings contig som det virkelige genomet kan utledes fra.
med andre ord så vil man bruke reads (en liten sekvens man får fra nsg)
og samler dem sammen. reads som overlapper vil bli slått sammen og disse kalles for contigs. de her er mye større men omfatter ikke hele genomet

Question 17

hva er binning (scaffold)?

Answer 17

For å analysere hver art i en
metagenomprøve individuelt,
sorteres contigs som hører til
riktig species hver for seg.
Dette kalles binning.

Question 18

hva er et mikrobiom?

Answer 18

Mikrobiom eller mikrobiota er den samlingen av alle mikroorganismer som lever på indre og ytre overflater hos mennesker, dyr, planter og sopp. Mikrobiomet omfatter mikroorganismer som har en viktig funksjon i organismen og er nyttige, men inneholder også harmløse mikroorganismer som verken er til gagn eller nytte. Noen av mikroorganismene i mikrobiomet kan være sykdomsfremkallende.

Mikrobiom kan også betegne alle mikroorganismene som danner samfunn på overflater i vann eller jord. Mange av bakteriene i mikrobiom danner biofilm med komplekse bakterie- og virussamfunn, og hvor produksjon av antibiotiske stoffer blir brukt i konkurransen.