CRISPR og NGS i forskning

Question 1

Hva avgjør hvilken behandling som bør gis til brystkreftpasienter?

Answer 1

Helhetsvurdering basert på:
- Pasientens alder
- Tumor og lymfeknutestatus (subtype, stadium etc.)
- Hormonreseptorstatus (østrogen og progesterone)
- HER2 status
- Prolifereringsstatus
- Genprofilstatus (risikoprofil)

Question 2

hva sjekker man ved PAM50 ROR test?

Answer 2

En genprofil-test som
brukes for å avgjøre hvilke
brystkreftpasienter som
etter operasjon bør ha
tilleggsbehandling med
cellegift og hvilke pasienter
som ikke behøver dette

Question 3

hvordan kan man finne gode biomarkører?

Answer 3

• Kliniske prøver/biopsier fra svært mange pasienter (mange hundre-flere tusen) og håpe at antall kompenserer for “støy”
• Bruke dyremodell for å redusere støy – bruke bioinformatikk for å evaluere relevans

Question 4

hva er forskjellene på transkriptomene til celler og tumorer?

Answer 4

• Fysiologiske faktorer (pH, næringstilgang, oksygen etc.) er endret
• Samspill mellom kreftceller, normale cellene og ECM påvirker genuttrykk
• En tumor er et komplekst nytt vev (transkriptomet til mange ulike celler) så man vet ikke hvilke celle sitt transkriptom man har funnet

Question 5

hvorfor er ofte NRF2 transkriptome aktivert i de aggresive tumorene?

Answer 5

NRF2 vil kode for antioksidanter ved oksidativ stress mot en celle. men dette gjelder også for kreftceller, så når granulocytter eller andre celler prøver
å bli kvitt dem vha oksidering vil NRF2 beskytte dem

Question 6

hvordan kan vi se om en transkriptom faktisk er viktig for en kreftcelle?

Answer 6

man slår ut effekten av transkriptome og sjekker om kreftcellene er like aggresive som de pleier å vær, er de endret eks mindre tumor vil det si at transkriptome faktisk var viktig for kreftutvikling

Question 7

er NRF2 aktivitet viktig for overlevelse?

Answer 7

Metastaser er hovedårsak til brystkreft-relatert død.
Hvis aktiviteten til Nrf2 er viktig for utvikling av metastaser → høy Nrf2 aktivitet bør predikere dårlig prognose

Question 8

hvordan vil behandlingen være for de som har økt/lavt uttrykk av NRF2?

Answer 8

Høyt uttrykk av Nrf2: Trenger “Tøff” behandling (flere bivirkninger) av Nrf2 signatur
Lavt uttrykk: Kan gis “lettere” behandling (færre bivirkninger)

Question 9

forklar singel cell sekvensering

Answer 9

man løser opp et vev slik at man gjenstår med enkelceller.
dna vil deretter gjennomgå pcr og dna trådene vil få en unik barkode festet på seg, spesifikk for sekvenseringen som de undergikk.
pga dette kan flere sekvensering produkter bli tilsatt i samme prøve.

Question 10

hvordan kan man finne ut av hvilke gener NRF2 styrer?

Answer 10

man kan blant annet bruke Chip-seq metode
Har en nokdown nrf2 og de som utrykker den normalt. Vi binder fast proteine til dna og bruker formaldehyd slik at de ikke kan slippe unna eller dette av (crosslinking) hvis vi gjør mye rart med cellene,
Dna blir delt opp med ultralyd, jo lenger tid jo mindre biter
Antistoffer mot nrf2 blir tilsatt og magnetiske kuler blir satt på antistoffene for å holde dem igjen mens alt annet blir vaska bort flere ganger
Løser opp cross linking og man får de korte dna bitene som mrna binde seg på. Bruker en spinnkolonne og ender opp kun med dna bitene vi leter etter

Question 11

hvordan funker CRISPR?

Answer 11

Guide rna sier til cas9 hvor den skal binde seg som deretter klipper opp dette området. Cellene prøver å reparere det her men det kan føre til feil og et ikke funksjonert gen. man kan også ha et templat som sier noe om hvordan det oppkuttete området skal ende opp

Question 12

hvordan kan man bruke lentivirus som et verktøy?

Answer 12

• Lentivirus brukes som vektor for overføring av genmateriale til vertsceller
• Kan i prinsippet transdusere celler uavhengig av celledeling, men er mest
  effektivt i celler med relativt rask celledeling
• Må inneholde seleksjonsmarkør for å velge ut de cellene som faktisk har fått
  virus (vanlig: antibiotika eller fluorescensmarkør) kan også tilsette puromisin som lyserer alle celler bortsett fra de med viruset.
• Ved bruk til CRISPR knockout (k.o.) må man også ha:
• gRNA
• Cas (vanligst Cas9 fra Streptococcus pyogenes)

Question 13

hvordan validerer man knockout?

Answer 13

bruker en positiv kontroll. sekvenserer minst 16 prøver om kromosomet har 4 kopier. sjekker om noen av disse er intakte, er de ikke det vil det si at knockout var suksessfult

Question 14

hvilke faktorer er et godt resultat av helgenom CRISPR avhenge av?

Answer 14

Godt resultat for helgenom CRISPR k.o.-screen er avhengig av
mange faktorer, blant annet:
* Cellene som undersøkes (kopitall av gener/kromosomer)
* Fordeling av sgRNA i cellene
* Kvaliteten på sgRNA-sekvensene (spesifisitet)
* God seleksjon (dvs. behandlingen som gis)

Question 15

hvordan verifiserer man CRISPR resultater?

Answer 15

• Se etter positiv kontroll og andre gener man antar er involvert
• Kategorisere «hits»
• Validere hver enkelt mulige «hit» med å slå ut (CRISPR) og gjøre funksjonelle assay
• Sjekke om det kan reproduseres i andre cellelinjer/-typer