NGS med mari Flashcards
forklar kort hva disse begrepene betyr: tagmentering, amplifisering, hybridisering, capturing og amplifisering
Tagmentering = (kutting og merking)
Amplifisering = (kopiering/oppformering av hele biblioteket som består av hele genomet)
Hybridisering = (Binde gener (genpanel) av interesse)
Capturing = (Drar ut gener av interesse)
Amplifisering = (kopiere gener av interesse)
hva er målet med bibliotekpreparering for genpaneler?
- Fragmentere (kutte) og merke DNA – får da et bibliotek bestående av «bøker» om hele genomet
- Ta ut de «bøkene» (genene) i biblioteket som vi er interessert i (Enrichment: hybridisering og
capturing) - Kopiere opp «bøkene» av interesse slik at de kan bli lest mange ganger på kort tid (amplifisering)
- Klar til lesing (sekvensering)
hva skjer i steg 1 i biblioteksprepareringen?
i steg 1 skjer det tagmentering av genomisk dna
Tagmentering er kutting og merking (tagging) av DNA, til DNA-fragmenter på ca 350 bp.
Fragmentene blir merket (tagget) med adaptere som er viktig for senere amplifisering (PCR).
Det blir benyttet et kulebasert tagmenterings-komples, som i en og samme prosess kutter DNA og
merker DNA fragmentene med adapter sekvenser
det som skjer er at kuler med adaptere og transposomer binder til seg en del av dna. deretter vil trådene bli kuttet til akuratt 350 bp når dette skjer vil den andre enden av dna tråden kunne binde seg til adaptoren på motsatt siden slik at vi får en buet form. det vil si at alle dna trådene vil få helt like adaptorer på sine 3 ende og andre helt like adaptorer på sin 5 ende.
hva skjer i steg 2 i biblioteksprepareringen?
nå blir prøven renset etter tagmenteringen av genomisk dna. vi stopper tagmenteringen/reaksjonen og vasker tagmentert dna på eBLT (bead linked transposome)
hva skjer i steg 3 i biblioteksprepareringen?
PCR: Amplifisering av tagmentert genomisk DNA (m/ Index merking)
Det vil være liten mengde av tagmentert genomisk DNA og vi må derfor oppkonsentrere biblioteket.
Primerene som blir tilsatt i PCR reaksjonen fester seg til adaptorene på hver side av DNA fragmentet som
ble satt på under tagmentering.
Primerene som brukes til PCR-reaksjonen består av 3 deler:
Primer del 1: Sekvens (Rd1 SP eller Rd2 SP) som er komplementær til adaptorene på hver ende av DNA fragmentet
(som ble satt på under tagmentering), som er nødvendig for selve PCR reaksjonen som nå skal utføres.
Primer del 2: Sekvens, som vil gi en unik identitet til hver prøve, som kalles Index.
Prøvene vil senere bli slått sammen (poole/mulitplexing) og det er Index-sekvensen som gjør det mulig identifisere
hvilken pasient DNA’et kommer fra.
Primer del 3: Sekvens (P5/P7) som er komplementær til oligoene på flowcellen som skal brukes til selve
sekvenseringen, som utføres etter bibliotekprepareringen.
etter festing vil dna polymerase binde seg og amplifisere sekvensene med primerne
hva skjer i steg 4 i biblioteksprepareringen?
Rensing av amplifisert tagmentert DNA, post-PCR
Vi har nå DNA fragmenter av ulik størrelse, som alle er merket med unik ID for hver
pasient. Vi ønsker å ta vare på de DNA fragmentene som er rundt 350 bp lange. Dette
blir gjort med en to trinns magnet-kulebasert rensetrinn.
etter vasking kan man kontrollere at man har oppnådd DNA fragmenter i riktig
størrelse med å kjøre en kvalitetssjekk på en bioanalyser som er et
chipbasert kapillær-elektroforesesystem.
hva skjer i steg 5 i biblioteksprepareringen?
Sammenslåing av prøver (Multiplexing)
Prøvene er når unikt merket, og kan derfor slåes sammen; multiplexes.
12 og 12 prøver blir slått sammen, slik at vi nå får fire 12-plex’er.
Før sammenslåing måles konsentrasjonen av hvert bibliotek og lik mengde DNA fra alle prøvene blir tilsatt hver
plex
hva skjer i steg 6 i biblioteksprepareringen?
Hybridisering av oligoer
Vi har nå et bibliotek for hver pasient.
Biblioteket består av DNA som er kuttet, merket og oppkonsentrert og DNA-fragmentene er
ca. 350 basepar lange.
DNA’et i biblioteket består fortsatt av DNA fra hele genomet.
Men vi er kun interessert i spesifikke gener, hvordan velge ut disse genene?
Tilsetter oligoer; spesifikke enkeltrådede DNA-sekvenser som er komplementær med
sekvenser i de gener vi ønsker å gå videre.
Oligoene er merket med Biotin og vil hybridisere (binde seg) med de delene av biblioteket
som vi ønsker å gå videre med. Hybridisering skjer over natt.
Denaturerer DNA og tilsetter oligoer som hybridiserer til de genene som vi ønsker å dra ut fra
resten av genomet (i hovedsak exonfragmenter).
For å få best utbytte av hybridiseringen, står den over natt (kan også gjøres på noen timer).
hva skjer i steg 7 i biblioteksprepareringen?
«Capture» Dra ut hybridiserte oligoer som er bundet til fragmenter
som vi ønsker å gå videre med
For å dra ut hybridiserte DNA-fragment, blir prøvebrettet satt på magnet. Magnetkulene med streptavidin, som
nå er bundet til biotin med hybridiserte fragment, dras mot magneten.
Pipetterer bort all væske i røret som inneholder DNA som ikke har bundet til oligoer.
DNA med biotin blir holdt fast mot magneten.
Prosessen kalles capturing
hva skjer i steg 8 i biblioteksprepareringen?
Amplifisering av Enriched bibliotek (PCR)
Sitter nå igjen kun med DNA-fragmenter fra gener som vi ønsker å gå videre med og det
settes på en siste PCR reaksjon før å øke konsentrasjonen.
hva skjer i steg 9 i biblioteksprepareringen?
Rensing av Amplifisering Enriched bibliotek
- Renser amplifisert enriched Bibliotek med magnetiske kuler
- Måler DNA-konsentrasjon på alle fire 12-plex
- Måler gjennomsnittlig lengde på bibliotekene
- De 4 plex’ene blir slått sammen til en 48-plex
- Fortynner biblioteket til ønsket konsentrasjon
- Biblioteket er nå klart for sekvensering
Viktig med rett DNA konsentrasjon, blir det tilsatt for mye DNA kan vi få «over clustring» og
setter vi på for lite, kan resultatet bli dårlig.
vi sjekker om alle trådene er 350bp lang ved kapilærelektroforese
hvordan foregår sekvenering ved syntese
Read 1: Sensetråden sekvenseres, en base settes på
og det blir tatt et bilde
Read 2: Reversetråden sekvenseres, en base settes på
og det blir tatt et bilde
Hver read har mange syklus. Syklus har med lengde på dna tråden å gjøre, leses vanligvis av ved at man har 150 syklus en vei og 150 syklus den andre veien.
hva kan skje ved over clustring?
De store «klattene» med mange cluster, blir
oppfattet av instrumentet som et cluster.
Clusterene blir derfor underestimert. (Får et lavere
tall enn hva det egentlig er), derfor blir rapportert
cluster i starten av flowcellen lavere i starten av
flowcellen enn på slutten der det blir mindre DNA
og instrumentet igjen klarer å telle riktig.
hva er formålet med clusters?
I flowcella er det oligoer som dna fester seg på. Når de er festa danner man en cluster, gjør det for å få en stor nok lyssignal slik at det kan registreres av instrumentet.
