RT-PCR et purification du fragment produit

Question 1

Que permet la PCR?

Answer 1

Reproduire des quantités considérables de séquences d’ADN spécifiques à partir d’un très faible nombre de copies d’ADN sans avoir besoin de cloner

Question 2

Que nécessite une réaction de PCR?

Answer 2

ADN matrice contenant séquence cible
ADN pol thermostable
2 amorces
Nucléotides
Tampon de réaction
Magnésium

Question 3

Combien de temps dure une réaction de PCR? Quel appareil sert à faie la réaction?

Answer 3

1 à 3h

Thermocycleur

Question 4

Quelles sont les 3 étapes d’un cycle d’amplification, combien de temps durent-elles et quelles sont les températures de chaque étape?

Answer 4

Dénaturation de l’ADN 95, 15s à 2 min
Hybridation des amorces entre 37 et 60, 20 à 60s
Extension des amorces 72, 1 à 2 min

Question 5

Décrire ce que fait l’ADN pol thermostable.

Answer 5

Allonge les amorces à partir du bout 3’ libre quand elles sont hybridées à une matrice d’ADN plus longue
Ajoute nucls complémentaires à la matrice

Question 6

Quelle est une solution simple à la contamination du matériel utilisé dans la réaction?

Answer 6

Séparer physiquement les produits utilisés avant et après l’amplification

Question 7

Pourquoi est-il toujours important de faire des témoins négatifs pour chaque réaction de la PCR?

Answer 7

Mettre en évidence une contamination éventuelle des réactifs par de l’ADN étranger

Question 8

À quoi sert la RT-PCR?

Answer 8

Produire un ADN de séquence complémentaire à un ARN d’intérêt

Question 9

Quelles sont les deux étapes de la RT-PCR?

Answer 9

1. transcription inverse

2. amplification par PCR

Question 10

À quoi consiste l’étape de transcription inverse?

Answer 10

Réaliser la synthèse d’un ADN qui est complémentaire à un ARN
ADNc produit par la transcriptase inverse (RT)

Question 11

Qu’est-ce que la transcriptase inverse?

Answer 11

ADN pol capable d’initier synthèse d’ADN à partir d’une amorce hybridée à un ARN

Question 12

Quels sont les deux types d’amorces utilisées dans la transcription inverse?

Answer 12

Oligo-T (pour s’hybrider à poly-A des ARNm)

Spécifique au gène

Question 13

Qu’est-il important de mettre dans la RT-PCR pour que l’ARN ne soit pas dégradé?

Answer 13

Inhibiteur de RNases (RNasin)

Question 14

Pourquoi la PCR est-elle essentielle après la RT?

Answer 14

Qté ADN insuffisante pour être détectée sur gel et pour les autres étapes du clonage, ADN doit être amplifié par PCR
ADN obtenu après PCR est double brin : essentiel au clonage

Question 15

Quel système utilisé en lab permet d’extraire des produits de la PCR d’un gel et permet de réduire à moins de 10 ul le volume final de l’ADN purifié?

Answer 15

MiniElute de Quiagen

Question 16

Que permet le fait de réduire à moins de 10 ul le volume final d’ADN purifié?

Answer 16

Permet que l’ADN purifié se retrouve en solution concentrée

Question 17

Pourquoi le fait que l’ADN se retrouve en solution concentrée après la colonne MiniElute est-il un avantage lorsqu’on veut insérer des fragments d’ADN dans un vecteur de clonage?

Answer 17

Car l’efficacité de la ligation de l’insert au vecteur dépend de la concentration du vecteur et de l’insert. En éluant l’ADN purifié du gel avec un faible volume, concentration de l’insert n’est plus un facteur limitant

Question 18

Que doit-on faire avant de mettre le gel dans la minicolonne?

Answer 18

Découper le gel et le solubiliser à l’aide d’un tampon pour ensuite déposer la solution sur une minicolonne

Question 19

Qu’est-ce qui favorise la liaison de l’ADN à la membrane de silice de la colonne dans le tampon de solubilisation?

Answer 19

Forte teneur en sels du tampon

Question 20

Que se passe-t-il pendant que l’ADN est dans la colonne et pourquoi?

Answer 20

Lavage à l’éthanol : retire contaminants par centrifugation

Éluer avec tampon sans sel : brise les liens ADN-silice

Question 21

Quel sel était contenu dans le tampon de solubilisation utilisé en lab (tampon QG)?

Answer 21

Thiocyanate de guanidine

Question 22

Comment se nomment les tampons de lavage et d’élution utilisés en lab?

Answer 22

Lavage = PE
Élution = EB