Extraction de l'ARN à l'aide du réactif Trizol Flashcards
Quel est le type de clonage effectué au projet 1?
Clonage de type U/A avec vecteur spécialisé pour insertion de produits de PCR
Quelle propriété a l’ADN polymérase Taq utilisée dans le PCR?
Ajouter un nucléotide A à l’extrémité 3’ de ses produits de PCR
Quelle molécule est compatible aux produits de PCR produits par l’ADN polymérase Taq?
Vecteur muni d’un U ou d’un T à ses extrémités
Quel vecteur a été utilisé pour le clonage du projet 1 et quelle est sa particularité?
Vecteur pDrive linéarisé et possède un nucléotide U à ses extrémités 3’
Quel ADN a été cloné dans le projet 1?
Fragment d’ADNc de la b-actine (ACTB)
Quelles son les particularités de l’actine?
Protéine exprimée dans toutes les cellules et fortement conservée chez les eucaryotes
Décrire la b-actine.
Protéine structurale, non musculaire, qui intervient dans la mobilité cellulaire
Comment a-t-on créé notre ADNc?
ARN de cellules qui expriment le gène de la b-actine a été extrait et purifié afin de produire l’ADNc (par RT-PCR avec amorces spécifiques à séquence de b-actine)
Quelles sont les 3 catégories d’ARN chez les eucaryotes?
ARN ribosomiques
ARN de transfert
ARN messagers
Quel sont les poids (sédimentation) des ARN ribosomiques?
28S
18S
5,8S
5S
Quel est le poids (sédimentation) des ARN de transfert?
5S
Quels sont les poids (sédimentation) des ARN messagers?
poids moléculaire et formes hétérogènes
Quel pourcentage de l’ARN cellulaire total constitue les ARN ribosomiques?
80%
Que signifie le fait que la valeur S est plus élevée?
Déplacement de la molécule plus rapide lorsque soumise à une force centrifuge
Taille de la molécule plus grande
Quel pourcentage de l’ARN cellulaire total constitue les ARN de transfert?
Environ 18%
Selon quelles propriétés peut-on purifier des ARN de transfert et pourquoi?
Selon leur poids ou leur densité car ils sont homogènes dans leur composition
Quel pourcentage de l’ARN cellulaire total constitue les ARN messagers?
Environ 2%
Les ARN messagers ont-ils les mêmes poids moléculaires et formes?
Non, poids et formes hétérogènes
Comment peut-on purifier des ARN messagers?
Par affinité sur colonne de cellulose oligo-(DT) (grâce à leur chaîne terminale polyadénylée)
Quels ARN sont impliqués dans les mécanismes de synthèse protéique de façon non-spécifique?
ARN de transfert
ARN ribosomique
Quels ARN déterminent le niveau d’expression des protéines de la cellule?
ARN messagers
Pourquoi s’intéresse-t-on aux ARN messagers dans la majorité des études cellulaires?
Puisqu’ils déterminent le niveau d’expression des protéines de la cellule
Qu’est-ce qui détermine la quantité d’ARN messagers à l’instant donné dans la cellule?
L’équilibre entre la vitesse de dégradation et la vitesse de synthèse
Où peut-on retrouver les ribonucléases?
Partout : cellules-mêmes des organes. réactif, sur les mains et sur la verrerie
Comment vérifie-t-on l’état de l’ARN après une extraction?
Sur gel d’agarose non dénaturant
Quelles bandes sont prédominantes sur gel d’agarose de l’ARN s’il est intact?
Bandes des ARNr 28S et 18S sont prédominantes en proportion environ 2:1
Autres bandes de poids moléculaires et intensités variables dont 5S
Quelles sont les 3 sources de contamination par les ribonucléases?
Matériel et solutions
Manipulateur
RNases de sources internes
Comment évite-t-on la contamination par le matériel?
Utiliser matériel stérile et à usage unique (idéalement en plastique)
Faire subir verrerie traitement : soit 180 degrés pendant 8 heures ou tremper pendant 10 min dans NaOH 0,5M et rincer avec eau
Comment évite-t-on la contamination par les solutions?
Préparer solutions avec eau exempte de nucléases et produits réservés juste pour manip avec ARN
Comment évite-t-on la contamination par le manipulateur?
Porter des gants jetables et les changer chq fois que contact avec vaisselle ou surfaces souillées
Comment évite-t-on la contamination par les sources externes?
Utiliser inhibiteurs de RNase :
- Détergents forts (SDS)
- Complexes Vanadyl-ribonucléoside
- Guanidine isothiocyanate 4M
Décrire les détergents forts (SDS).
Agents dénaturants très puissants, mais pas efficace à 100%
Décrire les complexes Vanadyl-ribonucléoside.
Inhibiteurs de RNase très efficaces
Doivent être séparés de l’ARN par extraction au phénol-chloroforme
(phénol = aussi agent dénaturant)
Décrire la guanidine isothiocyanate 4M.
Agent dénaturant très puissant qui, combiné à agent réducteur (b-mercaptoéthanol) détruit activité RNasique presque instantannément
Quel réactif dans le lab a servi à la lyse des cellules?
TRIzol
De quelles cellules a été extrait l’ARN dans le lab?
Fibroblastes de souris NIH 3T3
De quoi est composé le réactif TRIzol?
Solution monophasique de phénol et guanidine isothiocyanate
Que fait le réactif TRIzol?
Maintient l’intégrité de l’ARN pendant l’homogénéisation ou la lyse de l’échantillon
Fait éclater les cellules en dissolvant leur composantes cellulaires et en inactivant les RNases libérées
Quel réactif sert à la séparation de l’ARN?
Chloroforme
Quel réactif sert à la précipitation de l’ARN?
Isopropanol
Quelle solution sert au lavage de l’ARN?
Éthanol 75%
Quelle solution sert à la solubilisation de l’ARN?
Eau ultra pure
Quelles sont les étapes d’extraction de l’ARN (brièvement)?
Lyse des cellules Séparation de l'ARN Précipitation de l'ARN Lavage de l'ARN Solubilisation de l'ARN
Comment peut-on évaluer la concentration en ARN d’une solution?
Lecture de l’absorbance à 260 nm avec un spectrophotomètre
Sur quelle observation est basé le dosage de la concentration en ARN d’une solution au spectrophotomètre?
Bases puriques et pyrimidiques absorbent fortement à cette l.o.
Spectre d’absorption ADN et ARN max à 260 nm
À quelle concentration d’ARN correspond une unité à 260 nm?
40 ug ARN/ml
À quelle concentration d’ADN double brin correspond une unité à 260 nm?
50 ug ADN db/ ml
À quelle concentration d’ADN simple brin correspond une unité à 260 nm?
33 ug ADN sb / ml
Est-ce que toutes les bases azotées absorbent à 260 nm au même niveau?
Non
Que permet le dosage au spectrophotomètre?
Connaître qté ADN et ARN
permet d’avoir un indice de pureté de l’échantillon
Quels ratio informent de la présence d’autres molécules contaminantes dans l’échantillon?
260/280
260/230
Quelle composante contaminante baisse le ration 260/280?
Protéines
Quel appareil permet de faire le dosage d’ARN au lab?
NanoDrop
Quelle est la particularité du NanoDrop?
Conçu pour doser de très faibles volumes
Que permet de visualiser l’électrophorèse en gel d’agarose des extraits d’ARN?
Qualité de la préparation
Corroborer l’évaluation de la concentration établie au NanoDrop
