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TP biologie moléculaire > Extraction de l'ARN à l'aide du réactif Trizol > Flashcards

Extraction de l'ARN à l'aide du réactif Trizol Flashcards

1
Q

Quel est le type de clonage effectué au projet 1?

A

Clonage de type U/A avec vecteur spécialisé pour insertion de produits de PCR

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Q

Quelle propriété a l’ADN polymérase Taq utilisée dans le PCR?

A

Ajouter un nucléotide A à l’extrémité 3’ de ses produits de PCR

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3
Q

Quelle molécule est compatible aux produits de PCR produits par l’ADN polymérase Taq?

A

Vecteur muni d’un U ou d’un T à ses extrémités

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4
Q

Quel vecteur a été utilisé pour le clonage du projet 1 et quelle est sa particularité?

A

Vecteur pDrive linéarisé et possède un nucléotide U à ses extrémités 3’

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5
Q

Quel ADN a été cloné dans le projet 1?

A

Fragment d’ADNc de la b-actine (ACTB)

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6
Q

Quelles son les particularités de l’actine?

A

Protéine exprimée dans toutes les cellules et fortement conservée chez les eucaryotes

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7
Q

Décrire la b-actine.

A

Protéine structurale, non musculaire, qui intervient dans la mobilité cellulaire

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8
Q

Comment a-t-on créé notre ADNc?

A

ARN de cellules qui expriment le gène de la b-actine a été extrait et purifié afin de produire l’ADNc (par RT-PCR avec amorces spécifiques à séquence de b-actine)

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9
Q

Quelles sont les 3 catégories d’ARN chez les eucaryotes?

A

ARN ribosomiques
ARN de transfert
ARN messagers

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10
Q

Quel sont les poids (sédimentation) des ARN ribosomiques?

A

28S
18S
5,8S
5S

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11
Q

Quel est le poids (sédimentation) des ARN de transfert?

A

5S

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12
Q

Quels sont les poids (sédimentation) des ARN messagers?

A

poids moléculaire et formes hétérogènes

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13
Q

Quel pourcentage de l’ARN cellulaire total constitue les ARN ribosomiques?

A

80%

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14
Q

Que signifie le fait que la valeur S est plus élevée?

A

Déplacement de la molécule plus rapide lorsque soumise à une force centrifuge
Taille de la molécule plus grande

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15
Q

Quel pourcentage de l’ARN cellulaire total constitue les ARN de transfert?

A

Environ 18%

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16
Q

Selon quelles propriétés peut-on purifier des ARN de transfert et pourquoi?

A

Selon leur poids ou leur densité car ils sont homogènes dans leur composition

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17
Q

Quel pourcentage de l’ARN cellulaire total constitue les ARN messagers?

A

Environ 2%

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18
Q

Les ARN messagers ont-ils les mêmes poids moléculaires et formes?

A

Non, poids et formes hétérogènes

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19
Q

Comment peut-on purifier des ARN messagers?

A

Par affinité sur colonne de cellulose oligo-(DT) (grâce à leur chaîne terminale polyadénylée)

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20
Q

Quels ARN sont impliqués dans les mécanismes de synthèse protéique de façon non-spécifique?

A

ARN de transfert

ARN ribosomique

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21
Q

Quels ARN déterminent le niveau d’expression des protéines de la cellule?

A

ARN messagers

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22
Q

Pourquoi s’intéresse-t-on aux ARN messagers dans la majorité des études cellulaires?

A

Puisqu’ils déterminent le niveau d’expression des protéines de la cellule

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23
Q

Qu’est-ce qui détermine la quantité d’ARN messagers à l’instant donné dans la cellule?

A

L’équilibre entre la vitesse de dégradation et la vitesse de synthèse

24
Q

Où peut-on retrouver les ribonucléases?

A

Partout : cellules-mêmes des organes. réactif, sur les mains et sur la verrerie

25
Q

Comment vérifie-t-on l’état de l’ARN après une extraction?

A

Sur gel d’agarose non dénaturant

26
Q

Quelles bandes sont prédominantes sur gel d’agarose de l’ARN s’il est intact?

A

Bandes des ARNr 28S et 18S sont prédominantes en proportion environ 2:1
Autres bandes de poids moléculaires et intensités variables dont 5S

27
Q

Quelles sont les 3 sources de contamination par les ribonucléases?

A

Matériel et solutions
Manipulateur
RNases de sources internes

28
Q

Comment évite-t-on la contamination par le matériel?

A

Utiliser matériel stérile et à usage unique (idéalement en plastique)
Faire subir verrerie traitement : soit 180 degrés pendant 8 heures ou tremper pendant 10 min dans NaOH 0,5M et rincer avec eau

29
Q

Comment évite-t-on la contamination par les solutions?

A

Préparer solutions avec eau exempte de nucléases et produits réservés juste pour manip avec ARN

30
Q

Comment évite-t-on la contamination par le manipulateur?

A

Porter des gants jetables et les changer chq fois que contact avec vaisselle ou surfaces souillées

31
Q

Comment évite-t-on la contamination par les sources externes?

A

Utiliser inhibiteurs de RNase :

  • Détergents forts (SDS)
  • Complexes Vanadyl-ribonucléoside
  • Guanidine isothiocyanate 4M
32
Q

Décrire les détergents forts (SDS).

A

Agents dénaturants très puissants, mais pas efficace à 100%

33
Q

Décrire les complexes Vanadyl-ribonucléoside.

A

Inhibiteurs de RNase très efficaces
Doivent être séparés de l’ARN par extraction au phénol-chloroforme
(phénol = aussi agent dénaturant)

34
Q

Décrire la guanidine isothiocyanate 4M.

A

Agent dénaturant très puissant qui, combiné à agent réducteur (b-mercaptoéthanol) détruit activité RNasique presque instantannément

35
Q

Quel réactif dans le lab a servi à la lyse des cellules?

A

TRIzol

36
Q

De quelles cellules a été extrait l’ARN dans le lab?

A

Fibroblastes de souris NIH 3T3

37
Q

De quoi est composé le réactif TRIzol?

A

Solution monophasique de phénol et guanidine isothiocyanate

38
Q

Que fait le réactif TRIzol?

A

Maintient l’intégrité de l’ARN pendant l’homogénéisation ou la lyse de l’échantillon
Fait éclater les cellules en dissolvant leur composantes cellulaires et en inactivant les RNases libérées

39
Q

Quel réactif sert à la séparation de l’ARN?

A

Chloroforme

40
Q

Quel réactif sert à la précipitation de l’ARN?

A

Isopropanol

41
Q

Quelle solution sert au lavage de l’ARN?

A

Éthanol 75%

42
Q

Quelle solution sert à la solubilisation de l’ARN?

A

Eau ultra pure

43
Q

Quelles sont les étapes d’extraction de l’ARN (brièvement)?

A 
Lyse des cellules
Séparation de l'ARN
Précipitation de l'ARN
Lavage de l'ARN
Solubilisation de l'ARN
44
Q

Comment peut-on évaluer la concentration en ARN d’une solution?

A

Lecture de l’absorbance à 260 nm avec un spectrophotomètre

45
Q

Sur quelle observation est basé le dosage de la concentration en ARN d’une solution au spectrophotomètre?

A

Bases puriques et pyrimidiques absorbent fortement à cette l.o.
Spectre d’absorption ADN et ARN max à 260 nm

46
Q

À quelle concentration d’ARN correspond une unité à 260 nm?

A

40 ug ARN/ml

47
Q

À quelle concentration d’ADN double brin correspond une unité à 260 nm?

A

50 ug ADN db/ ml

48
Q

À quelle concentration d’ADN simple brin correspond une unité à 260 nm?

A

33 ug ADN sb / ml

49
Q

Est-ce que toutes les bases azotées absorbent à 260 nm au même niveau?

A

Non

50
Q

Que permet le dosage au spectrophotomètre?

A

Connaître qté ADN et ARN

permet d’avoir un indice de pureté de l’échantillon

51
Q

Quels ratio informent de la présence d’autres molécules contaminantes dans l’échantillon?

A

260/280

260/230

52
Q

Quelle composante contaminante baisse le ration 260/280?

A

Protéines

53
Q

Quel appareil permet de faire le dosage d’ARN au lab?

A

NanoDrop

54
Q

Quelle est la particularité du NanoDrop?

A

Conçu pour doser de très faibles volumes

55
Q

Que permet de visualiser l’électrophorèse en gel d’agarose des extraits d’ARN?

A

Qualité de la préparation

Corroborer l’évaluation de la concentration établie au NanoDrop

TP biologie moléculaire (11 decks)

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