Assemblage de Gibson Flashcards
À quoi sert l’assemblage de Gibson?
Joindre plusieurs fragments d’ADN en une seule étape
Combien de fragments est-il réaliste d’assembler sans que l’efficacité diminue?
Jusqu’à 6 fragments
Quelles sont les tailles habituelles des fragments à assembler et de quelles sources proviennent-ils?
Tailles variables (250 pb à 100 kpb) Différentes sources (produits de digestion, PCR, synthèse artificielle, etc)
Qu’est-ce qui est nécessaire pour la réaction d’assemblage?
Région d’homologie entre les fragments sur 20 à 40 pb à chaque extrémité des fragments
Régions d’homologie guident ordre et orientation des fragments assemblés
Quelles sont les 3 enzymes utilisées dans la réaction d’assemblage de Gibson et dans quoi les retrouve-t-on?
Mélange réactionnel :
1 - 5’-exonucléase du bactériophage T5
2 - ADN pol
3 - Ligase
Que fait la 5’-exonucléase du bactériophage T5?
Dégrade les brins d’ADN à partir de leurs extrémités 5’ : génère des extensions 3’ simple brins (extrémités des extensions 3’ s’hybrident ensemble puisqu’elles sont homologues entre les fragments à assembler
Quelles enzymes des 3 enzymes de la réaction de Gibson sont thermophiles?
ADN pol et ligase
Qu’est-ce qui protège les fragments d’une dégradation complète par la 5’-exonucléase du bactériophage T5 dans la réaction de Gibson?
Le fait que la réaction se fasse à 50 degrés pendant 1h inactive l’enzyme avec le temps : protège fragemnts de dégradation complète
Quel est le résultat de l’assemblage de Gibson et à quoi ce résultat peut-il servir?
Résultat : ADN double brin
Sert à : matrice pour PCR, clonage moléculaire ou conception de nouveaux systèmes et fonctions biologiques dans biologie synthétique
Pourquoi utilise-t-on l’application ApE en laboratoire lorsque nous faisons un clonage par assemblage de Gibson?
Permet de bien définir la séquence du plasmide à construire : permet de récupérer les séquences d’ADN à assembler pour former le plasmide désiré
(permet aussi d’analyser l’ADN par digestions enzymatiques virtuelles, annoter les séquences, conception d’amorces et plus)
Nommer les principales étapes d’un clonage par assemblage de Gibson en partant de la planification du plasmide à construire jusqu’à l’assemblage des fragments avec les réactifs de Gibson.
1 - planifier le plasmide à construire
2 - conception des amorces pour amplifier les fragments (et/ou vecteur) avec homologie entre les fragments à assembler
3 - amplifier les fragments par PCR avec une ADN pol haute-fidélité et préparer le vecteur par PCR ou digestion enzymatique
4 - Assembler les fragments avec réactifs de Gibson
Qu’est-ce qu’une amorce (ou oligonucléotides)?
Courts fragments d’ADN obtenus par synthèse chimique
Comment définit-on la séquence des amorces?
Selon les besoins de l’expérimentateur
D’abord il faut connaître séquence à amplifier
Ensuite déterminer les nucls qui composeront les amorces en fonction de l’expérience à réaliser
Les amorces dans l’assemblage de Gibson sont-elles conçues de la même façon que pour un PCR usuel?
Non
Quelles sont les deux parties que doivent contenir les amorces pour l’assemblage de Gibson?
Partie spécifique à l’ADN à amplifier «PCR»
Partie homologue au fragment à joindre du côté 5’ «Assemblage»
Quelle longueur et quel Tm devrait avoir la partie PCR d’une amorce pour un assemblage de Gibson?
Entre 18 et 30 nucls et Tm d’environ 60 degrés
Quelle longueur et quel Tm devrait avoir la partie Assemblage d’une amorce pour un assemblage de Gibson?
Entre 20 à 40 nucls et Tm d’au moins 50 degrés
Décrire la méthode de mutagenèse dirigée par la PCR.
Mutation désirée introduite dans une amorce (tant que la mutation n’empêche pas l’hybridation en 3’) et amplification par PCR
Quelle partie de l’amorce peut être modifiée (insérer une mutation) sans que cela n’affecte l’hybridation de celle-ci?
Partie 5’
À quoi un assemblage de Gibson est fréquemment couplé?
Mutagenèse dirigée par la PCR
Dans quelle partie de l’amorce utilisée pour l’assemblage de Gibson les mutations sont-elles introduites?
Assemblage
De quel organisme provient la GFP?
Méduse Aequorea victoria
Quelles sont les caractéristiques générales de la GFP?
Très stable et émet une fluorescence caractéristique en réponse à une excitation par une longueur d’onde appropriée
Qu’est-il possible de faire lorsqu’on remplace certains aa de la GFP?
Modifier la fluorescence : intensité et l.o. de la lumière d’émission
Qu’est-ce qui va permettre la purification par chromatographie d’affinité de la protéine encodée par le plasmide?
Étiquette histidine (His-tag) (au moins 6 histidines)
Comment se fait l’ajout d’un éhis-tag?
Par des amorces contenant la séquence encodée par le plasmide
Où et comment doit être inséré le motif His-tag pour qu’il puisse être exprimé?
À l’extrémité N ou C-terminale et inséré dans le cadre de lecture de la protéine d’intérêt
Dans la GFP recombinante formée dans le laboratoire, l’étiquette His-tag est à quelle extrémité?
C-terminale
Quels sont les 4 éléments essentiels apportés par les fragments assemblés dans le laboratoire?
Gène araC
Séquence du promoteur inductible PBAD
Séquence ori
Gène de résistance à la kanamycine
Décrire le gène araC.
Code pour la protéine régulatrice de l’expression AraC : gène de régulation du catabolisme et de l’anabolisme
À quoi sert le promoteur PBAD et quel est son inducteur?
Sert à : contrôler expression de GFP
Inducteur : arabinose
Que permet la séquence ori?
Permet reconnaissance et réplication du plasmide par l’hôte
Que permet le gène de résistance à la kanamycine?
Permet sélection des transformants
Comment peut-on estimer la quantité d’ADN d’un échantillon dans un gel d’agarose?
Avec un marqueur tel que le «Low DNA mass ladder»
Masse d’ADN de chq fragment du marqueur est connue : qté d’ADN approximée en comparant avec les bandes du marqueur
Sur quel fait est basé la méthode d’estimation de la qté d’ADN?
Sur le fait que le colorant (GelRed) se lie de façon proportionnelle à la qté d’ADN
L’assemblage de Gibson nécessite-t-il une quantité très exacte d’ADN ou une approximation convient?
Une approximation convient
Quel ratio est généralement opté pour chacun des fragments dans une réaction d’assemblage de Gibson?
1 : 1
Mais dans certains cas rapport différent (ex : rapport vecteur : insert = 5 : 1
À quoi sert un témoin de fragments non assemblés transformés dans une bactérie pour l’assemblage de Gibson?
Vérifier la présence de faux +
Sert à vérifier que les colonies ont pas accepté un ADN matrice qui a servi à faire les fragments
À quoi sert un témoin avec le plasmide pGlo?
Détermine la compétence de la bactérie
Quel calcul permet de déterminer l’efficacité de la transformation?
Nb transformants / ug d’ADN
