Assemblage de Gibson

Question 1

À quoi sert l’assemblage de Gibson?

Answer 1

Joindre plusieurs fragments d’ADN en une seule étape

Question 2

Combien de fragments est-il réaliste d’assembler sans que l’efficacité diminue?

Answer 2

Jusqu’à 6 fragments

Question 3

Quelles sont les tailles habituelles des fragments à assembler et de quelles sources proviennent-ils?

Answer 3

Tailles variables (250 pb à 100 kpb)
Différentes sources (produits de digestion, PCR, synthèse artificielle, etc)

Question 4

Qu’est-ce qui est nécessaire pour la réaction d’assemblage?

Answer 4

Région d’homologie entre les fragments sur 20 à 40 pb à chaque extrémité des fragments
Régions d’homologie guident ordre et orientation des fragments assemblés

Question 5

Quelles sont les 3 enzymes utilisées dans la réaction d’assemblage de Gibson et dans quoi les retrouve-t-on?

Answer 5

Mélange réactionnel :
1 - 5’-exonucléase du bactériophage T5
2 - ADN pol
3 - Ligase

Question 6

Que fait la 5’-exonucléase du bactériophage T5?

Answer 6

Dégrade les brins d’ADN à partir de leurs extrémités 5’ : génère des extensions 3’ simple brins (extrémités des extensions 3’ s’hybrident ensemble puisqu’elles sont homologues entre les fragments à assembler

Question 7

Quelles enzymes des 3 enzymes de la réaction de Gibson sont thermophiles?

Answer 7

ADN pol et ligase

Question 8

Qu’est-ce qui protège les fragments d’une dégradation complète par la 5’-exonucléase du bactériophage T5 dans la réaction de Gibson?

Answer 8

Le fait que la réaction se fasse à 50 degrés pendant 1h inactive l’enzyme avec le temps : protège fragemnts de dégradation complète

Question 9

Quel est le résultat de l’assemblage de Gibson et à quoi ce résultat peut-il servir?

Answer 9

Résultat : ADN double brin
Sert à : matrice pour PCR, clonage moléculaire ou conception de nouveaux systèmes et fonctions biologiques dans biologie synthétique

Question 10

Pourquoi utilise-t-on l’application ApE en laboratoire lorsque nous faisons un clonage par assemblage de Gibson?

Answer 10

Permet de bien définir la séquence du plasmide à construire : permet de récupérer les séquences d’ADN à assembler pour former le plasmide désiré
(permet aussi d’analyser l’ADN par digestions enzymatiques virtuelles, annoter les séquences, conception d’amorces et plus)

Question 11

Nommer les principales étapes d’un clonage par assemblage de Gibson en partant de la planification du plasmide à construire jusqu’à l’assemblage des fragments avec les réactifs de Gibson.

Answer 11

1 - planifier le plasmide à construire
2 - conception des amorces pour amplifier les fragments (et/ou vecteur) avec homologie entre les fragments à assembler
3 - amplifier les fragments par PCR avec une ADN pol haute-fidélité et préparer le vecteur par PCR ou digestion enzymatique
4 - Assembler les fragments avec réactifs de Gibson

Question 12

Qu’est-ce qu’une amorce (ou oligonucléotides)?

Answer 12

Courts fragments d’ADN obtenus par synthèse chimique

Question 13

Comment définit-on la séquence des amorces?

Answer 13

Selon les besoins de l’expérimentateur
D’abord il faut connaître séquence à amplifier
Ensuite déterminer les nucls qui composeront les amorces en fonction de l’expérience à réaliser

Question 14

Les amorces dans l’assemblage de Gibson sont-elles conçues de la même façon que pour un PCR usuel?

Answer 14

Non

Question 15

Quelles sont les deux parties que doivent contenir les amorces pour l’assemblage de Gibson?

Answer 15

Partie spécifique à l’ADN à amplifier «PCR»

Partie homologue au fragment à joindre du côté 5’ «Assemblage»

Question 16

Quelle longueur et quel Tm devrait avoir la partie PCR d’une amorce pour un assemblage de Gibson?

Answer 16

Entre 18 et 30 nucls et Tm d’environ 60 degrés

Question 17

Quelle longueur et quel Tm devrait avoir la partie Assemblage d’une amorce pour un assemblage de Gibson?

Answer 17

Entre 20 à 40 nucls et Tm d’au moins 50 degrés

Question 18

Décrire la méthode de mutagenèse dirigée par la PCR.

Answer 18

Mutation désirée introduite dans une amorce (tant que la mutation n’empêche pas l’hybridation en 3’) et amplification par PCR

Question 19

Quelle partie de l’amorce peut être modifiée (insérer une mutation) sans que cela n’affecte l’hybridation de celle-ci?

Answer 19

Partie 5’

Question 20

À quoi un assemblage de Gibson est fréquemment couplé?

Answer 20

Mutagenèse dirigée par la PCR

Question 21

Dans quelle partie de l’amorce utilisée pour l’assemblage de Gibson les mutations sont-elles introduites?

Answer 21

Assemblage

Question 22

De quel organisme provient la GFP?

Answer 22

Méduse Aequorea victoria

Question 23

Quelles sont les caractéristiques générales de la GFP?

Answer 23

Très stable et émet une fluorescence caractéristique en réponse à une excitation par une longueur d’onde appropriée

Question 24

Qu’est-il possible de faire lorsqu’on remplace certains aa de la GFP?

Answer 24

Modifier la fluorescence : intensité et l.o. de la lumière d’émission

Question 25

Qu’est-ce qui va permettre la purification par chromatographie d’affinité de la protéine encodée par le plasmide?

Answer 25

Étiquette histidine (His-tag) (au moins 6 histidines)

Question 26

Comment se fait l’ajout d’un éhis-tag?

Answer 26

Par des amorces contenant la séquence encodée par le plasmide

Question 27

Où et comment doit être inséré le motif His-tag pour qu’il puisse être exprimé?

Answer 27

À l’extrémité N ou C-terminale et inséré dans le cadre de lecture de la protéine d’intérêt

Question 28

Dans la GFP recombinante formée dans le laboratoire, l’étiquette His-tag est à quelle extrémité?

Answer 28

C-terminale

Question 29

Quels sont les 4 éléments essentiels apportés par les fragments assemblés dans le laboratoire?

Answer 29

Gène araC
Séquence du promoteur inductible PBAD
Séquence ori
Gène de résistance à la kanamycine

Question 30

Décrire le gène araC.

Answer 30

Code pour la protéine régulatrice de l’expression AraC : gène de régulation du catabolisme et de l’anabolisme

Question 31

À quoi sert le promoteur PBAD et quel est son inducteur?

Answer 31

Sert à : contrôler expression de GFP

Inducteur : arabinose

Question 32

Que permet la séquence ori?

Answer 32

Permet reconnaissance et réplication du plasmide par l’hôte

Question 33

Que permet le gène de résistance à la kanamycine?

Answer 33

Permet sélection des transformants

Question 34

Comment peut-on estimer la quantité d’ADN d’un échantillon dans un gel d’agarose?

Answer 34

Avec un marqueur tel que le «Low DNA mass ladder»

Masse d’ADN de chq fragment du marqueur est connue : qté d’ADN approximée en comparant avec les bandes du marqueur

Question 35

Sur quel fait est basé la méthode d’estimation de la qté d’ADN?

Answer 35

Sur le fait que le colorant (GelRed) se lie de façon proportionnelle à la qté d’ADN

Question 36

L’assemblage de Gibson nécessite-t-il une quantité très exacte d’ADN ou une approximation convient?

Answer 36

Une approximation convient

Question 37

Quel ratio est généralement opté pour chacun des fragments dans une réaction d’assemblage de Gibson?

Answer 37

1 : 1

Mais dans certains cas rapport différent (ex : rapport vecteur : insert = 5 : 1

Question 38

À quoi sert un témoin de fragments non assemblés transformés dans une bactérie pour l’assemblage de Gibson?

Answer 38

Vérifier la présence de faux +

Sert à vérifier que les colonies ont pas accepté un ADN matrice qui a servi à faire les fragments

Question 39

À quoi sert un témoin avec le plasmide pGlo?

Answer 39

Détermine la compétence de la bactérie

Question 40

Quel calcul permet de déterminer l’efficacité de la transformation?

Answer 40

Nb transformants / ug d’ADN