RNA interferente

Question 1

¿Qué es el RNAi?

Answer 1

mecanismo biológico que regula la expresión génica mediante dsRNA (RNA de doble cadena) que actúa como una señal para bloquear un gen

Question 2

¿En qué consiste el RNAi?

Answer 2

Silenciamiento específico de genes mediante RNA de doble cadena (dsRNA) que lleva a la degradación del mRNA objetivo

Question 3

¿Qué necesitamos para producir dsRNA?

Answer 3

• Plásmido L4440, contiene:
• Promotores T7: señales que dicen donde se empieza a hacer el dsRNA
• Gen de resistencia a amplicilina: asegura que las bacterias sobreviven si tienen el plásmido correcto
• Cepa HT115 (E. coli)
• no destruye el dsRNA porque le quitamos una enzima llamada RNAase III

Question 4

¿Cómo hacemos que las bacterias produzcan dsRNA?

Answer 4

1. cultivamos las bacterias en un medio con ampicilina para asegurarnos de que sólo las que tienen el plásmido crezcan
2. añadimos IPTG (interruptor que activa al operón Lac)

Question 5

¿Cómo llega el dsRNA a los gusanos?

Answer 5

el dsRNA producido por las bacterias se usa para alimentar al C. elegans

cuando se comen las bacterias, el dsRNA entra a su sistema y apaga el gen que queremos estudiar

Question 6

Elementos del plásmido L4440

(un vector circular de ADN diseñado para que las bacterias puedan producir dsRNA específico para un gen blanco9

Answer 6

• Gen de resistencia a ampicilina :
  para seleccionar bacterias que tienen este plásmido, porque sólo estas crecerán en medios con ampicilina
• Sitio de multiclonación:
  segmento donde se inserta el fragmento de DNA que codifica el dsRNA del gen que nos interesa
• Promotores T7:
  secuencias que inician la transcripción del dsRNA cuando se activa la RNA polimerasa T7 en las bacterias

Question 7

Elementos de la cepa HT115 (E. coli)

(Bacteria genéticamente modificada para trabajar con RNAi)

Answer 7

• No tiene el gen RNAse III, lo que evita que degrade el dsRNA que producirá
• Lac-Pro
  Controla la transcripción usando el operón Lac
• Gen de polimerasa T7
  transcribe el ADN del plásmido L4440 en dsRNA
• Gen tetR
  resistencia a tetraciclina, otro antibiótico para seleccionar bacterias

Question 8

¿Cómo se introduce el plásmido L4440 en la bacteria? (Proceso llamado transformación bacteriana)

Answer 8

Se mezclan

Se les hace un choque térmico para que los poros de la membrana de la bacteria se abran y el plásmido entre

Después del procedimiento, las bacterias se cultivan en un medio de ampicilina, las que introdujeron correctamente el plásmido sobreviven

Question 9

Elementos de las bacterias transformadas (HT115 + L4440)

Answer 9

• Sistema Lac-Pro activable:
  controla producción de dsRNA
• Plásmido L4440 incorporado:
  instrucciones para producir dsRNA del gen blanco

Question 10

¿Cómo funciona el operón Lac?

Answer 10

• Sin lactosa:

I + Lac = NO Pol = NO transcripción de genes

• el represor (I) se une al promotor lac (Lac-Pro) y bloquea a la RNA polimerasa (Pol), evitando la transcripción de los genes Lac (Lac Z, Y, A)
• Con lactosa (IPTG):

I + IPTG = NO I = SÍ Lac = SÍ Pol = SÍ transcripción de genes

• el inductor (IPTG) se une al represor (I) y lo inactiva
• esto libera el promotor lac (Lac-Pro)m y permite que la RNA polimerasa transcriba los genes bajo su control

Question 11

Genes que se transcriben después de la activación del Lac-Pro

Answer 11

T7: produce RNA polimerasa T7

TetR: confirma la resistencia a tetraciclina

Question 12

IPTG

Answer 12

imita la función de la lactosa pero no es degradado por las bacterias

Question 13

¿Cómo se introduce el dsRNA en el gusano?

Answer 13

El gusano se come las bacterias que producen dsRNA

el dsRNA va al intestino, donde el receptor SID-2 lo capta y lo introduce al citoplasma

el canal SID-1 transporta el dsRNA a todo el gusano

SID-1 está presente en todas las células excepto en las neuronas

Question 14

¿Qué le ocurre al dsRNA una vez dentro de la célula?

Answer 14

1. complejo DICER (enzima) corta el dsRNA en fragmentos llamados siRNAs primarios (21-24 nucleótidos)
2. siRNAs reconocidos por proteínas como RDE-1 (C. elegans) o AGO-2 (mamíferos)
3. siRNAs + proteínas Argonauta (RDE-1) = complejo RISC
4. RISC guía siRNA al mRNA blanco
5. RISC corta el mRNA complementario al siRNA
6. se bloquea la producción de la proteína codificada por el gen silenciado
7. RdRP (enzima) amplifica el silenciamiento creando siRNAs secundarios (22 nucelótidos)

Question 15

Formas de hacer RNAi en C. elegans

Answer 15

• Por alimentación:
• simple, no invasivo
• medio NGM + Amp + Tet + IPTG
• Microinyección:
• muy preciso
• PCR en algún tejido
• Por “remojo”:
• rápido y sencillo
• se remojan en una solución dsRNA que se absorbe en la cutícula

Question 16

Formas de hacer RNAi en drosophila

Answer 16

• microinyección
• vector viral
• transgen GAL4/UAS

Question 17

Formas de hacer RNAi in vitro

Answer 17

• transfección de siRNA
• transfección de plásmido
• vector viral
• entrega del siRNA (inyección)
• vector viral (inyección)
• sistema CRE-Lox

Question 18

Protocolo RNAi en C. Elegans

Answer 18

1. Preparación de bacterias:
   - HT115 + L4440
   - cultivar E. coli HT115 en medio de ampicilina
2. Producción de dsRNA:
   - incubar bacterias con IPTG para inducir producción
3. Inoculación de gusanos
   - sembrar gusanos en placas con bacterias
4. Observación
   - pads de agar
   - observar fluoresencia (fluorece = control, no fluorece = RNAi)