DNA recombinante Flashcards
Enrique Chávez
¿Qué es DNA recombinante (rADN)?
técnica que consiste en cortar y unir secuencias de ADN de diferentes fuentes para crear ADN artificial
Vectores
vehículos donde se colocan las secuencias de ADN recombinado
Función de los vectores
transportan el ADN hacia el lugar adecuado de la célula huésped donde puede ser copiado o expresado
Molécula de DNA recombinante
molécula generada de segmentos de DNA provenientes de organismos distintos
¿cómo se obtiene el DNA de organismos distintos?
por métodos de recombinación genética, clonación…
aplicaciones del rADN
plantas transgénicas
animales transgénicos
producción de hormonas
producción de vacunas
ingeniería enzimática
¿cómo se hace el rADN?
- cortar DNA con enzimas de restricción
- plásmido recombinante = plásmido + gen: ligasa une los extremos pegajosos de ambos fragmentos
- transformación: introducir el plásmido recombinante en bacterias por heat shock
- selección de bacterias transformadas
- colonias de bacterias
Enzimas de restricción (nucleasas)
proteínas capaces de reconocer secuencias específicas en el DNA y cortar en esos sitios
generan extremos cohesivos o “pegajosos” que facilitan la unión con el plásmido
Plásmido
pequeña molécula de DNA circular que existe naturalmente en bacterias
tienen sitios de restricción donde se puede insertar el gen de interés
¿para qué se utiliza el plásmido?
como vector para transportar genes
Sitio de restricción
secuencia específica de nucleótidos donde una enzima de restricción puede unirse y realizar un corte
son cortas (4 y 8 pares de bases)
Heat shock
manera de meter el plásmido recombinante en bacterias
las bacterias se mezclan con el plásmido y se someten a un cambio rápido de temperatura, lo que abre temporalmente los poros en la membrana de las bacterias
¿Cómo funciona la selección de bacterias transformadas?
el plásmido contiene un gen de resistencia a antibióticos
al cultivar las bacterias en un medio con ese antibiótico, colo las que hayan recibido el plásmido sobrevivirán
características de rADN
enlace fosfodiéster
enlace N-glicosídico
¿dónde cortan las enzimas de restricción (nucleasas)?
en los enlaces fosfodiésters
tipos de nucleasas
exonucleasas:
- cortan en posiciones terminales
- genera cadena polinucleotídica acortada
- monofosfato y bifosfato
endonucleasas:
- cortan en nucleótidos internos
- genera dos fragmentos polinucleotídicos
criterios de especificidad de las nucleasas
Actúan sobre alguno de los tipos de enlace fosfoéster:
- tipo a: hidroliza fosfato en OH3’, genera extremos 3’-OH y 5’P
- tipo b: hidroliza fosfato en OH5’
Reconocimiento de nucleósidos
permite a las enzimas saber el tipo de ácido nucleico (DNA o RNA) con el que están interactuando
¿cómo se reconocen los nucleósidos?
por la pentosa:
- DNA: desoxirribosa
- RNA: ribosa
por la base nitrogenada
ejemplo de enzimas que reconocen nucleósidos
RNasa I:
- degrada RNA
- actúa sobre la ribosa
DNasa II:
- degrada DNA
- reconoce la desoxirribosa
familias de nucleasas
tipo I:
- endonucleasa y metilasa en una misma proteína (misma proteína tiene dos actividades enzimáticas)
- sitio de reconocimiento no palindrómico
tipo II:
- endonucleasa (metilasa en otra proteína)
- sitio de reconocimiento palindrómico
tipo III:
- endonucleasa y metilasa
- sitio de reconocimiento no palindrómico
¿de qué requieren las endonucleasas para funcionar?
ATP
Mg2+
SAM
ejemplo de reconocimiento de nucleósidos: RNasa I (tipo b)
actúa sobre enlaces en los que el ribonucleósido del lado 5’ es pirimidínico (C, U)
(corta después de Up o Cp)
(5’) pApGpUp GpUp Cp GpCp ApUp A (3’)⟶ pApGpUp + GpUp + Cp + GpCp + ApUp + A
ejemplo de reconocimiento de nucleósidos: DNasa II (tipo b)
Hidroliza el enlace entre nucleósidos purínico (A, G) y pirimidínico (C, T)
(corta ente Gp y Tp, Gp y Cp o Ap y Tp, Ap y Cp)
(5’) pApGpTpGpTpCpGpCpApTpA (3’) ⟶ pApGp + TpGp + TpCpGp + CpAp + TpA
tipos de extremos que generan las enzimas de restricción
simétricos (romo):
- más difíciles de unir
- ej: Smal
asimétricos (cohesivos):
- ej: EcoRI
isoesquizómeros
enzimas que cortan en el mismo sitio de ADN y generan el mismo extremo cohesivo
policonector
secuencia de ADN sintética presente en los plásmidos que contiene múltiples sitios de reconocimiento para diferentes enzimas de restricción
Pasos preparación de DNA
- aislamiento de DNA genómico
- fragmentación con enzimas de restricción: cortas el gen de interés y el vector (plásmido)
- aislamiento del fragmento a clonar
¿qué es el proceso de clonación?
método para obtener copias de un fragmento específico de DNA, como un gen de interés
Proceso de clonación
- preparación del DNA
- preparación del vector
- métodos de introducción de rDNA a la célula huésped
- propagación en cultivo
- resultados
preparación del vector
tenemos que digerir el vector con una enzima de restricción
características de un vector (plásmido)
DNA circular
tiene origen de replicación
gen de resistencia a algún antibiótico
lac Z:
- gen reportero
- X-gal es un sustrato cromogénico artificial que al ser degradado por la beta{galactosa, produce un color azul (las azules no tienen el inserto)
- gen que codifica para la beta-galactosidasa (degrada glucosa y galactosa que son una fuente de energía)
métodos de unión a secuencias complementarias
directo:
- el vector tiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción
indirecto:
- no tiene la secuencia de reconocimiento
- usan policonector: varios sitios de reconocimiento para diferentes enzimas
posibles resultados de unión
concatenación:
- varios insertos se unen en lugar de unirse con el vector
- varios vectores unidos sin insertar el fragmento deseado
unión intra-molecular:
- el inserto se une consigo mismo
- el vector se une consigo mismo (vector recircularizado)
vector + inserto:
- resultado deseado
¿qué hace la fosfatasa alcalina?
quita el grupo fosfato
como necesitamos un grupo fosfato para que la ligasa funcione, la ligasa no se une
métodos de introducción de rDNA a la célula huésped
choque de calor
lipofección (liposomas)
electroporación (cargas eléctricas)
transfección (virus)
Mapas de restricción
determina la posición relativa de los lugares de corte con otro en la molécula de ADN
sustituyes el mapa con los fragmentos de las 4 digestiones hasta que te quede un fragmento de 23 kb
interpretación de mapas de restricción
4 bandas –> 3 sitios de restricción para restrictasa A
2 bandas –> 1 sitio para B
5 bandas –> 4 sitios digestión doble
métodos de detección y selección de clones recombinantes
hibridación (sonda marcada)
inmunoquímicos (anticuerpo)
genéticos (producto azul)
