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Técnicas y Herramientas II > DNA recombinante > Flashcards

DNA recombinante Flashcards

Enrique Chávez

1
Q

¿Qué es DNA recombinante (rADN)?

A

técnica que consiste en cortar y unir secuencias de ADN de diferentes fuentes para crear ADN artificial

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Q

Vectores

A

vehículos donde se colocan las secuencias de ADN recombinado

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3
Q

Función de los vectores

A

transportan el ADN hacia el lugar adecuado de la célula huésped donde puede ser copiado o expresado

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4
Q

Molécula de DNA recombinante

A

molécula generada de segmentos de DNA provenientes de organismos distintos

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5
Q

¿cómo se obtiene el DNA de organismos distintos?

A

por métodos de recombinación genética, clonación…

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6
Q

aplicaciones del rADN

A

plantas transgénicas
animales transgénicos
producción de hormonas
producción de vacunas
ingeniería enzimática

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7
Q

¿cómo se hace el rADN?

A
  1. cortar DNA con enzimas de restricción
  2. plásmido recombinante = plásmido + gen: ligasa une los extremos pegajosos de ambos fragmentos
  3. transformación: introducir el plásmido recombinante en bacterias por heat shock
  4. selección de bacterias transformadas
  5. colonias de bacterias
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8
Q

Enzimas de restricción (nucleasas)

A

proteínas capaces de reconocer secuencias específicas en el DNA y cortar en esos sitios

generan extremos cohesivos o “pegajosos” que facilitan la unión con el plásmido

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9
Q

Plásmido

A

pequeña molécula de DNA circular que existe naturalmente en bacterias

tienen sitios de restricción donde se puede insertar el gen de interés

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10
Q

¿para qué se utiliza el plásmido?

A

como vector para transportar genes

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11
Q

Sitio de restricción

A

secuencia específica de nucleótidos donde una enzima de restricción puede unirse y realizar un corte

son cortas (4 y 8 pares de bases)

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12
Q

Heat shock

A

manera de meter el plásmido recombinante en bacterias

las bacterias se mezclan con el plásmido y se someten a un cambio rápido de temperatura, lo que abre temporalmente los poros en la membrana de las bacterias

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13
Q

¿Cómo funciona la selección de bacterias transformadas?

A

el plásmido contiene un gen de resistencia a antibióticos

al cultivar las bacterias en un medio con ese antibiótico, colo las que hayan recibido el plásmido sobrevivirán

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14
Q

características de rADN

A

enlace fosfodiéster
enlace N-glicosídico

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15
Q

¿dónde cortan las enzimas de restricción (nucleasas)?

A

en los enlaces fosfodiésters

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16
Q

tipos de nucleasas

A

exonucleasas:
- cortan en posiciones terminales
- genera cadena polinucleotídica acortada
- monofosfato y bifosfato

endonucleasas:
- cortan en nucleótidos internos
- genera dos fragmentos polinucleotídicos

17
Q

criterios de especificidad de las nucleasas

A

Actúan sobre alguno de los tipos de enlace fosfoéster:

  • tipo a: hidroliza fosfato en OH3’, genera extremos 3’-OH y 5’P
  • tipo b: hidroliza fosfato en OH5’
18
Q

Reconocimiento de nucleósidos

A

permite a las enzimas saber el tipo de ácido nucleico (DNA o RNA) con el que están interactuando

19
Q

¿cómo se reconocen los nucleósidos?

A

por la pentosa:
- DNA: desoxirribosa
- RNA: ribosa

por la base nitrogenada

20
Q

ejemplo de enzimas que reconocen nucleósidos

A

RNasa I:
- degrada RNA
- actúa sobre la ribosa

DNasa II:
- degrada DNA
- reconoce la desoxirribosa

21
Q

familias de nucleasas

A

tipo I:
- endonucleasa y metilasa en una misma proteína (misma proteína tiene dos actividades enzimáticas)
- sitio de reconocimiento no palindrómico

tipo II:
- endonucleasa (metilasa en otra proteína)
- sitio de reconocimiento palindrómico

tipo III:
- endonucleasa y metilasa
- sitio de reconocimiento no palindrómico

22
Q

¿de qué requieren las endonucleasas para funcionar?

A

ATP
Mg2+
SAM

23
Q

ejemplo de reconocimiento de nucleósidos: RNasa I (tipo b)

A

actúa sobre enlaces en los que el ribonucleósido del lado 5’ es pirimidínico (C, U)

(corta después de Up o Cp)

(5’) pApGpUp GpUp Cp GpCp ApUp A (3’)⟶ pApGpUp + GpUp + Cp + GpCp + ApUp + A

24
Q

ejemplo de reconocimiento de nucleósidos: DNasa II (tipo b)

A

Hidroliza el enlace entre nucleósidos purínico (A, G) y pirimidínico (C, T)

(corta ente Gp y Tp, Gp y Cp o Ap y Tp, Ap y Cp)

(5’) pApGpTpGpTpCpGpCpApTpA (3’) ⟶ pApGp + TpGp + TpCpGp + CpAp + TpA

25
Q

tipos de extremos que generan las enzimas de restricción

A

simétricos (romo):
- más difíciles de unir
- ej: Smal

asimétricos (cohesivos):
- ej: EcoRI

26
Q

isoesquizómeros

A

enzimas que cortan en el mismo sitio de ADN y generan el mismo extremo cohesivo

27
Q

policonector

A

secuencia de ADN sintética presente en los plásmidos que contiene múltiples sitios de reconocimiento para diferentes enzimas de restricción

28
Q

Pasos preparación de DNA

A
  1. aislamiento de DNA genómico
  2. fragmentación con enzimas de restricción: cortas el gen de interés y el vector (plásmido)
  3. aislamiento del fragmento a clonar
29
Q

¿qué es el proceso de clonación?

A

método para obtener copias de un fragmento específico de DNA, como un gen de interés

30
Q

Proceso de clonación

A
  1. preparación del DNA
  2. preparación del vector
  3. métodos de introducción de rDNA a la célula huésped
  4. propagación en cultivo
  5. resultados
31
Q

preparación del vector

A

tenemos que digerir el vector con una enzima de restricción

32
Q

características de un vector (plásmido)

A

DNA circular

tiene origen de replicación

gen de resistencia a algún antibiótico

lac Z:
- gen reportero
- X-gal es un sustrato cromogénico artificial que al ser degradado por la beta{galactosa, produce un color azul (las azules no tienen el inserto)
- gen que codifica para la beta-galactosidasa (degrada glucosa y galactosa que son una fuente de energía)

33
Q

métodos de unión a secuencias complementarias

A

directo:
- el vector tiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción

indirecto:
- no tiene la secuencia de reconocimiento
- usan policonector: varios sitios de reconocimiento para diferentes enzimas

34
Q

posibles resultados de unión

A

concatenación:
- varios insertos se unen en lugar de unirse con el vector
- varios vectores unidos sin insertar el fragmento deseado

unión intra-molecular:
- el inserto se une consigo mismo
- el vector se une consigo mismo (vector recircularizado)

vector + inserto:
- resultado deseado

35
Q

¿qué hace la fosfatasa alcalina?

A

quita el grupo fosfato

como necesitamos un grupo fosfato para que la ligasa funcione, la ligasa no se une

36
Q

métodos de introducción de rDNA a la célula huésped

A

choque de calor
lipofección (liposomas)
electroporación (cargas eléctricas)
transfección (virus)

37
Q

Mapas de restricción

A

determina la posición relativa de los lugares de corte con otro en la molécula de ADN

sustituyes el mapa con los fragmentos de las 4 digestiones hasta que te quede un fragmento de 23 kb

38
Q

interpretación de mapas de restricción

A

4 bandas –> 3 sitios de restricción para restrictasa A

2 bandas –> 1 sitio para B

5 bandas –> 4 sitios digestión doble

39
Q

métodos de detección y selección de clones recombinantes

A

hibridación (sonda marcada)
inmunoquímicos (anticuerpo)
genéticos (producto azul)

Técnicas y Herramientas II (14 decks)

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