DNA recombinante

Question 1

¿Qué es DNA recombinante (rADN)?

Answer 1

técnica que consiste en cortar y unir secuencias de ADN de diferentes fuentes para crear ADN artificial

Question 2

Vectores

Answer 2

vehículos donde se colocan las secuencias de ADN recombinado

Question 3

Función de los vectores

Answer 3

transportan el ADN hacia el lugar adecuado de la célula huésped donde puede ser copiado o expresado

Question 4

Molécula de DNA recombinante

Answer 4

molécula generada de segmentos de DNA provenientes de organismos distintos

Question 5

¿cómo se obtiene el DNA de organismos distintos?

Answer 5

por métodos de recombinación genética, clonación…

Question 6

aplicaciones del rADN

Answer 6

plantas transgénicas
animales transgénicos
producción de hormonas
producción de vacunas
ingeniería enzimática

Question 7

¿cómo se hace el rADN?

Answer 7

1. cortar DNA con enzimas de restricción
2. plásmido recombinante = plásmido + gen: ligasa une los extremos pegajosos de ambos fragmentos
3. transformación: introducir el plásmido recombinante en bacterias por heat shock
4. selección de bacterias transformadas
5. colonias de bacterias

Question 8

Enzimas de restricción (nucleasas)

Answer 8

proteínas capaces de reconocer secuencias específicas en el DNA y cortar en esos sitios

generan extremos cohesivos o “pegajosos” que facilitan la unión con el plásmido

Question 9

Plásmido

Answer 9

pequeña molécula de DNA circular que existe naturalmente en bacterias

tienen sitios de restricción donde se puede insertar el gen de interés

Question 10

¿para qué se utiliza el plásmido?

Answer 10

como vector para transportar genes

Question 11

Sitio de restricción

Answer 11

secuencia específica de nucleótidos donde una enzima de restricción puede unirse y realizar un corte

son cortas (4 y 8 pares de bases)

Question 12

Heat shock

Answer 12

manera de meter el plásmido recombinante en bacterias

las bacterias se mezclan con el plásmido y se someten a un cambio rápido de temperatura, lo que abre temporalmente los poros en la membrana de las bacterias

Question 13

¿Cómo funciona la selección de bacterias transformadas?

Answer 13

el plásmido contiene un gen de resistencia a antibióticos

al cultivar las bacterias en un medio con ese antibiótico, colo las que hayan recibido el plásmido sobrevivirán

Question 14

características de rADN

Answer 14

enlace fosfodiéster
enlace N-glicosídico

Question 15

¿dónde cortan las enzimas de restricción (nucleasas)?

Answer 15

en los enlaces fosfodiésters

Question 16

tipos de nucleasas

Answer 16

exonucleasas:
- cortan en posiciones terminales
- genera cadena polinucleotídica acortada
- monofosfato y bifosfato

endonucleasas:
- cortan en nucleótidos internos
- genera dos fragmentos polinucleotídicos

Question 17

criterios de especificidad de las nucleasas

Answer 17

Actúan sobre alguno de los tipos de enlace fosfoéster:

• tipo a: hidroliza fosfato en OH3’, genera extremos 3’-OH y 5’P
• tipo b: hidroliza fosfato en OH5’

Question 18

Reconocimiento de nucleósidos

Answer 18

permite a las enzimas saber el tipo de ácido nucleico (DNA o RNA) con el que están interactuando

Question 19

¿cómo se reconocen los nucleósidos?

Answer 19

por la pentosa:
- DNA: desoxirribosa
- RNA: ribosa

por la base nitrogenada

Question 20

ejemplo de enzimas que reconocen nucleósidos

Answer 20

RNasa I:
- degrada RNA
- actúa sobre la ribosa

DNasa II:
- degrada DNA
- reconoce la desoxirribosa

Question 21

familias de nucleasas

Answer 21

tipo I:
- endonucleasa y metilasa en una misma proteína (misma proteína tiene dos actividades enzimáticas)
- sitio de reconocimiento no palindrómico

tipo II:
- endonucleasa (metilasa en otra proteína)
- sitio de reconocimiento palindrómico

tipo III:
- endonucleasa y metilasa
- sitio de reconocimiento no palindrómico

Question 22

¿de qué requieren las endonucleasas para funcionar?

Answer 22

ATP
Mg2+
SAM

Question 23

ejemplo de reconocimiento de nucleósidos: RNasa I (tipo b)

Answer 23

actúa sobre enlaces en los que el ribonucleósido del lado 5’ es pirimidínico (C, U)

(corta después de Up o Cp)

(5’) pApGpUp GpUp Cp GpCp ApUp A (3’)⟶ pApGpUp + GpUp + Cp + GpCp + ApUp + A

Question 24

ejemplo de reconocimiento de nucleósidos: DNasa II (tipo b)

Answer 24

Hidroliza el enlace entre nucleósidos purínico (A, G) y pirimidínico (C, T)

(corta ente Gp y Tp, Gp y Cp o Ap y Tp, Ap y Cp)

(5’) pApGpTpGpTpCpGpCpApTpA (3’) ⟶ pApGp + TpGp + TpCpGp + CpAp + TpA

Question 25

tipos de extremos que generan las enzimas de restricción

Answer 25

simétricos (romo): - más difíciles de unir - ej: Smal asimétricos (cohesivos): - ej: EcoRI

Question 26

isoesquizómeros

Answer 26

enzimas que cortan en el mismo sitio de ADN y generan el mismo extremo cohesivo

Question 27

policonector

Answer 27

secuencia de ADN sintética presente en los plásmidos que contiene múltiples sitios de reconocimiento para diferentes enzimas de restricción

Question 28

Pasos preparación de DNA

Answer 28

1. aislamiento de DNA genómico 2. fragmentación con enzimas de restricción: cortas el gen de interés y el vector (plásmido) 3. aislamiento del fragmento a clonar

Question 29

¿qué es el proceso de clonación?

Answer 29

método para obtener copias de un fragmento específico de DNA, como un gen de interés

Question 30

Proceso de clonación

Answer 30

1. preparación del DNA 2. preparación del vector 3. métodos de introducción de rDNA a la célula huésped 4. propagación en cultivo 5. resultados

Question 31

preparación del vector

Answer 31

tenemos que digerir el vector con una enzima de restricción

Question 32

características de un vector (plásmido)

Answer 32

DNA circular tiene origen de replicación gen de resistencia a algún antibiótico lac Z: - gen reportero - X-gal es un sustrato cromogénico artificial que al ser degradado por la beta{galactosa, produce un color azul (las azules no tienen el inserto) - gen que codifica para la beta-galactosidasa (degrada glucosa y galactosa que son una fuente de energía)

Question 33

métodos de unión a secuencias complementarias

Answer 33

directo: - el vector tiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción indirecto: - no tiene la secuencia de reconocimiento - usan policonector: varios sitios de reconocimiento para diferentes enzimas

Question 34

posibles resultados de unión

Answer 34

concatenación: - varios insertos se unen en lugar de unirse con el vector - varios vectores unidos sin insertar el fragmento deseado unión intra-molecular: - el inserto se une consigo mismo - el vector se une consigo mismo (vector recircularizado) vector + inserto: - resultado deseado

Question 35

¿qué hace la fosfatasa alcalina?

Answer 35

quita el grupo fosfato como necesitamos un grupo fosfato para que la ligasa funcione, la ligasa no se une

Question 36

métodos de introducción de rDNA a la célula huésped

Answer 36

choque de calor lipofección (liposomas) electroporación (cargas eléctricas) transfección (virus)

Question 37

Mapas de restricción

Answer 37

determina la posición relativa de los lugares de corte con otro en la molécula de ADN sustituyes el mapa con los fragmentos de las 4 digestiones hasta que te quede un fragmento de 23 kb

Question 38

interpretación de mapas de restricción

Answer 38

4 bandas --> 3 sitios de restricción para restrictasa A 2 bandas --> 1 sitio para B 5 bandas --> 4 sitios digestión doble

Question 39

métodos de detección y selección de clones recombinantes

Answer 39

hibridación (sonda marcada) inmunoquímicos (anticuerpo) genéticos (producto azul)