PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

Question 1

Una PCR es:

Answer 1

amplificación (aumentar cantidad) in vitro (en un tubo de ensayo) de una secuencia de una región específica de ADN/ácidos nucléicos

síntesis enzimática de DNA usando DNA polimerasa

Question 2

Finalidades de la PCR:

Answer 2

cuantificar
identificar mutaciones
ver si hay presencia o ausencia de un gen

Question 3

¿Qué hace la DNA polimerasa?

Answer 3

hace una copia complementaria a partir de una cadena templado (molde)

Question 4

¿Cómo sabe la DNA polimerasa qué nucléotidos ir metiendo?

Answer 4

a través de un enlace fosfodiéster se libera pirofosfato

Question 5

Pasos del ciclo de síntesis

Answer 5

1. Desnaturalización:
   - 90°C
   - 20s - 60s
   - las hebras de ADN se separan y quedan como cadenas templado
2. Alineamiento (Hibridación):
   - 50°C
   - 15s- 60s
   - los primers se unen a las regiones de interés en cada una de las cadenas sencillas
3. Elongación:
   - 30s - 3 min
   - la ADN polimerasa extiende los primers, añadiendo nucleótidos a la cadena

Question 6

¿Qué se necesita para la síntesis de DNA?

Answer 6

• DNA templado (genómico, cDNA, DNA de plásmido)
• primers (2 o juegos para multiplex)
• dNTPs
• DNA polimerasa
• buffer/cofactor

Question 7

¿Qué es Tm?

Answer 7

temperatura media de disociación (desnaturalización)

punto de inflexión donde la mitad de las moléculas están disociadas

cada primer tiene un Tm diferente

Question 8

¿Qué indica Tm baja, muy alta o muy diferentes?

Answer 8

Tm baja:
- amplificación inespecífica
- útil para secuencias similares

Tm muy alta:
- da poco producto
- dificulta alineamiento

Tm´s diferentes:
- da poco producto
- amplificación asimétrica

Question 9

Los softwares hacen análisis de:

Answer 9

fluorescencia
RIN: índice de integridad del RNA