CRISPR-Cas

Question 1

¿Qué es CRISPR-Cas?

Answer 1

Sistema de defensa inmune adaptativo que poseen bacterias y arqueas para protegerse de infecciones virales

Question 2

CRIPSR

Answer 2

Secuencias repetitivas de ADN intercaladas con fragmentos de ADN viral (spacers) que actúan como un registro de infecciones pasadas

Question 3

Proteínas Cas

Answer 3

asociadas a CRIPSR

cortan el ADN viral y añaden nuevos spacers

Question 4

Fases del sistema CRIPSR-Cas

Answer 4

1. Adaptación
   - fragmentos de ADN viral son incorporados como spacers en las secuencias CRIPSR
2. Expresión
   - las secuencias CRIPSR son transcritas en pre-crRNA y procesadas para formar crRNAs funcionales
   - crRNAs guían a las proteínas Cas a secuencias virales específicas
3. Interferencia
   - las proteínas Cas, reconocen y cortan el ADN invasor en la secuencia blanco (protospacer) que tiene el motivo PAM adyacente

Question 5

Componentes del sistema CRIPSR-Cas9

Answer 5

Cas9:
- “tijera molecular”
- corta sitios específicos de doble cadena
- requiere la presencia del PAM (NGG) para funcionar

crRNA (RNA guía):
- tiene una secuencia espaciadora de 20 nucleótidos que reconoce la secuencia blanco

tracrRNA:
- forman un complejo con el crRNA y Cas9

PAM:
- secuencia corta que indica donde Cas9 corta el ADN

Question 6

Mecanismos de reparación post-corte

Answer 6

1. unión de extremos no homólogos (NHEJ):
   - unión directa de los extremos del ADN
   - puede introducir indels (deleciones/inserciones)
   - impreciso
2. reparación dirigida por homología (HDR)
   - usa un molde para corregir o insertar cambios específicos
   - preciso
   - depende de la fase del ciclo celular

Question 7

Aplicaciones

Answer 7

1. Edición genética:
   - Knock-in (inserción)
   - Knock out (eliminación)
   - para anemia, enfermedades metabólicas y cáncer
2. Edición de bases:
   - cambios en ADN sin cortes de doble cadena, evitando indels
3. Estudios de funcionalidad genética:
   - identificación de genes responsables de resistencia a fármacos

Question 8

Limitaciones

Answer 8

Cas puede cortar en sitios no deseados, solución:
- RNA guías más cortas
- variantes de Cas con alta fidelidad
- técnicas de entrega mejoradas (electroporación, nanopartículas)

Question 9

Spacer

Answer 9

fragmentos únicos de ADN viral integrados en las secuencias CRISPR

Question 10

PAM (protospacer adjacent motif)

Answer 10

secuencia en el ADN objetivo que permite a las proteínas Cas9 identificar el sitio correcto para cortar

el motivo más común es NGG

Question 11

off target

Answer 11

efectos no deseados, cuando el sistema corta o edita en sitios de ADN que no son el objetivo

Question 12

causas principales de off-target

Answer 12

• desajustes en el RNA guía
• secuencias homólogas