Protein methods Flashcards
Hvad er det genomiske dogme?
Det er udviklingen af proteiner fra DNA til RNA til protein.
Hvad består proteiner af?
Aminosyrer, som består af en central carbon atom sammensat med en aminogruppe, en carboxylgruppe, et hydrogen atom og en varibel komponent kaldet sidekæde.
Hvilket kemikalie kan nedbryde disulfidbindinger?
Beta-mercaptoethanol
Hvornår er et aminosyre en kation?
Ved lave pH´er
Hvornår er et aminosyre en anion?
Ved høje pH´er
Hvornår er et aminosyre en Zwitterion?
Ved en bestemt intermediær pH, hvor den ikke er ladet, men stadig er ioniserede
Hvad er det isoionic point?
Den pH hvor Zwitterioner er dominerende
Hvornår vil anion og zwitterion kunne være i ligevægt sammen?
Når pH er højere end det isoionic point (pI)
Hvornår vil cation og zwitterion kunne være i ligevægt sammen?
Når pH er lavere end det isoionic point (pI)
Hvorfor er ioniserings mønstret anderledes for aspartansyre?
Fordi den har to carboxyl grupper som kan ioniseres
Hvorfor er ioniserings mønstret anderledes for Lysin?
Fordi den har to amino grupper, som kan modtage protoner.
Hvordan kan små forskelle i aminosyre detekteres?
Electroforetisk
Ion-excange chromatografisk seperation
Under formeringen af proteiner vil aminogrupperne og carboxylgrupperne blive brugt i peptidbindinger og kan derfor ikke længere ioniseres, udover de to terminaler. Istedet er det sidekæderne der er frie til at kunne ioniseres. Hvilke sidesæder kan der side på et peptid?
Aminogrupper Carboxylgrupper Amidazolyl grupper Guanidino grupper Phenolic grupper Sulphyldryl grupper
Når proteiner folder, hvor vil sidekæderne da placerer sig og hvilken funktion har de for proteinet?
De vil så vidt muligt side på ydersiden af proteinet så de interagerer med omgivelserne.
Derudover hjælper de til at danne den tertiære struktur.
Hvad er det isoelectriske punkt for et protein?
Den pH hvor proteinet er elektroforetisk immobilt.
Hvad bruges en extraction buffer til og hvad er vigtigt i sammensætningen af den?
Den bruges til at stabiliserer de proteiner, som man gerne vil udvinde.
Derfor er det vigtigt at pH´en er det samme som inde i cellen.
Dertil er der specielle tilsætninger alt efter hvilke proteiner man ønsker at isolerer.
Hvad er de mest brugte extraction buffers?
Tris
Phosphate
Hvad gør anti-oxidanter i en extraction buffer?
Forhindre inter- og intramolekulære disulfidbindinger mellem proteiner som frigives i bufferen.
Nævn nogle anti-oxidanter
Dithiothreitol
Beta-mercaptoethanol
Cystein
Glutathion
Hvad gør enzym-inhibitorer i en extraction buffer?
Blokerer proteaser og proteolytiske enzymer fra lysosomer, der kan skade proteinerne.
Udover enzym-inhibitorer hvad kan man ellers gøre for at forhindre proteolyse?
Under hele oprensningen arbejdes der ved 4 grader.
Hvad gør enzym substrat og cofaktorer i en extraction buffer?
Stabiliserer enzymer ved at substratet binder til den aktive del af enzymet. De relevante cofaktorer som mistes i oprensningen tilføjes for at vedligeholde enzym aktiviteten.
Hvad gør EDTA i en extraction buffer?
Fjerner metalioner som reagere med thiol gruppen i proteiner.
Fjerner også magnesium og calcium.
Hvad gør sodium azide i en extraction buffer?
Holder bufferen fri for bakterier og svampe så det opbevares i længere tid.
Membran proteiner er svære at udvinde da de ikke frigøres ved almindelig ødelæggelses procedure. Hvilke to former for membran proteiner finde der?
Extrinsiske og intrinsiske
Hvordan oprenser man extrinsiske membran proteiner?
Hæve ionisk konc. i extraktionsbufferen til 1 M NaCl
Ændre pH til 3-5 eller 9-12.
Hvordan oprenser man intrinsiske membran proteiner?
Bufferen skal have tilført detergenter, såsom SDS, sodium deoxycholate
Eller non-ionic detegenter såsom Triton x-100
Hvordan kan mammalian celler blive ødelagt?
ved shear forces
Nævn de forskellige typer af metoder til at ødelægge celler
Blenders Slibning Presning Enzymatiske metoder Lydbølger
Hvilken celler ødelægger man med blender metoden?
Mammalian celler eller plantevæv, da blendning opbygger shear forces.
Hvilken celler ødelægger man med slibning metoden?
Planteceller
Bakterier
Hvilken celler ødelægger man med presning metoden?
Mikrobakterielle celler
Hvilken celler ødelægger man med enzymatisk metoden?
Gram-positive bakterier
Gram-negative bakterier
Svampe/gær
Hvilken celler ødelægger man med lydbølge metoden?
Mammalian celler
Mikrobakterielle celler
Hvad er ideen bag fraktionerings metoder?
At inddele proteiner yderligere i f.eks. hydrofobe og hydrofile, som vil gøre oprensningen nemmere.
Nævn nogle fraktionerings metoder man kan bruge
Ladning
Størrelse
Affinitet
Hydrophobisitet
Hvilke fraktionerings metoder kan bruges inden oprensning?
Hydrofobicitet
Ladning
Hvilke fraktionerings metoder kan bruges efter oprensning?
Affinitet
Størrelse
Proteiner kan blive modificeret ved overudtrykke gener for proteiner frem for at klone dem, som gøres for at sikre sekretion af proteiner fra cellen eller som et mål for oprensning af proteiner. Hvad er fordelen ved at modificerer gener for proteiner?
Der vil være mindre kontaminering af andre proteiner, da cellen frigiver det til mediet.
Undgår nedbrydning af proteinet i cellen
Undgår at proteinet bliver toksisk for cellen
Proteinerne undergår post-translationelle modifikationer
For at sikre at man selektivt oprenser sit protein tilføjer man et ekstra gen til genet for proteinet, kaldet fusion protein. Når proteinet bliver udtrykt kan fusion proteinet kløves væk for at frigive proteinet. Nævn eksempler på fusion proteiner
Flag^TM Glutathione affinity agarose Protein A Poly(arginin) Maltose bindende protein tag (MBP) His tag
Beskriv hvordan Flag bruges i oprensning
En aminosekvens påsættes N-terminalen af proteinet
Et monoklonal Flag antistof tilsættes sammen med calcium, da det er calcium afhængigt.
Herefter tilsættes EDTA som binder til calcium og derved frigiver Flag proteinet
Enterokinase tilsættes som fjerner Flag sekvensen
Beskriv hvordan glutathion affinity agarose bruges i oprensning
Sit protein er udtrykt som et fusions protein med enzymet glutathion S-transferase siddende på sig.
extraktet filtreres igennem et rør med glutathion ´-linked agarose beads, som enzymet vil binde til.
Når alt det protein som ikke har fusions protein på sig er løbet igennem kan man tilsætte en elution blanding som består af reduceret glutathion.
Til sidst kløves fusions proteinet vha. human trombin
Beskriv hvordan protein A bruges i oprensning
Sit protein er fusioneret med Protein A, som kan binde til Fc regionen af IgG.
Efter oprensning kan IgG fjernes vha. en hæj saltopløsning eller lav pH
Herefter fjernes protein A fra sit protein ved at behandle det med 70% formic acid i 2 dage, som kløver den syre-labile Asp-Pro binding i linker regionen.
Beskriv hvordan Maltose binding protein (MBP) tag kan bruges i oprensning
Sit protein er fusioneret med MBP, som kan oprenses ved at tilføje amylose resin.
Amylose resin kan efter oprensning fjernes med maltose.
MBP delen kan fjernes ved en specifik protease
Sit protein kan herefter seperares fra MBP ved at bruge affinity chromatografi.
Nævn forskellige chromatografi metoder
Affinity chromatografi
Ion exchange chromatografi
Size exclusion chromatografi
Hvordan fungerer Affinity chromatografi?
Ved at isolerer sit protein på baggrund af dens binding til en ligand
Hvordan fungerer ion exchange chromatografi?
Ved at isolerer sit protein på baggrund af dens ladning
Hvordan fungerer size exclusion chromatografi?
Ved at isolerer sit protein på baggrund af dens størrelse
Hvad er den gennemgående metode til at måle protein koncentrationer?
At man farver med et farvestof der binder til proteinet, som derefter kan detekteres spektrofotometrisk.
Beskriv kort hvordan affinity chromatography virker
Man har et rør hvor der er matrix i.
I matrixen er der noget der hedder en spacer, som gør at liganden ikke binder direkte til matrixen.
Herefter tilsættes liganden til matrixen og ens proteiner tilføjes.
Kontaminerede proteiner vaskes ud af prøven.
Det bundne protein kan fjernes ved at ændre ion konc. eller pH eller ved en kompatativ substans, som senere kan fjernes på samme måde.
Hvilke typer matrix kan bruges i affinity chromatography
Agarose Polycrylamide Polystyrene Cellulose Silica
Nævn de to exchanger den stationerer fase kan være i ved ion exchange chromatography og hvad forskellen er på de to
Cation exchanger, som er negativ ladet = positive proteiner
Anion exchanger, som er positiv ladet = negative proteiner
Hvad kan bruges som cation exchanger?
Carboxyl
Carboxyl methyl
Sulpho
Sulpho methyl
Nævn de buffere man bruger med en cation exchanger
Acetat
Phosphat
Succinate
Lacetate
Hvad kan bruges som anion exchanger?
Aminoethyl
Trimethyl aminoethyl
Nævn de buffere man bruger med en anion exchanger
Tris
Pyridin
Hvad er røret i size excange chromatography fyldt med?
Gel med purose beads
Hvad kan gelen bestå af i size excange chromatography?
Polystyrene
Dextran
Polyacrylamide
Agarose gel
