Fixation of tissue

Question 1

Beskriv den typiske workflow for den TYPISKE histologiske forberedelse af væv.

Answer 1

Kollektion af prøven 
Fixering 
Embedding 
Sectioning 
Farvning 
Mikroskopi 
Report

Question 2

Hvad er formålet med fixering?

Answer 2

At stoppe enzymatisk nedbrydning

Bevarer vævs morfologien

Question 3

Hvad gør fixativet strukturelt ved proteiner?

Answer 3

Ændre den tertiære struktur

Ændre den kemiske og antigen forholdet af proteinerne sammenlignet med den native form.

Question 4

Er det godt at fixere sit væv, hvis man ønsker at bruge det i antistof-antigen interaktioner?

Answer 4

Nej

Question 5

Nævn to aldehyder

Answer 5

Formaldehyde

Glutaraldehyde

Question 6

Hvad er den kemiske formel for formaldehyde og hvilken del er aldehyde delen?

Answer 6

HCHO

Aldehyde = CHO

Question 7

Formaldehyde er opløselig i vand og danner methylene hydrate er denne form lige så god som formaldehyde?

Answer 7

Ja, de har samme karakteristisk

Question 8

Hvad er den kemiske formel for methylene hydrate?

Answer 8

HO-CH2-OH

Question 9

Hvad sker der når methylene hydrater reagerer med hinanden?

Answer 9

De danner polymerer

Question 10

Hvad er formalin en blanding af?

Answer 10

40 % formaldehyde

60% vand

Question 11

Hvad er paraformaldehyde?

Answer 11

Formaldehyde polymerer med 100 repeated units, som gør at de er uopløselige.

Question 12

Hvordan nedbrydes paraformaldehyde?

Answer 12

Ved at varme det til 60 grader

Question 13

Hvad er en typisk brugbar blanding af formaldehyde?

Answer 13

en fortynding mellem 4 til 10%

Question 14

Beskriv hvordan formaldehyde/methylene hydrat fixerer vævet?

Answer 14

Det er aldehyde gruppen på methylene hydratet der binder til proteinet.
Denne gruppe kan derved med aldehyde gruppe bind et nyt protein. Herved er proteinerne ikke længere opløselige.

Question 15

Beskriv teksturen af cytoplasmaet af en celle efter fixering

Answer 15

Gel agtigt.

Question 16

Hvilke komponenter fixeres ikke af formaldehyde og hvordan forbliver de uopløselige?

Answer 16

Lipider, DNA og kulhydrater.

De fanges i networket af uopløselige cross-links.

Question 17

Hvad gør at fixering kan lede til background staining?

Answer 17

Formaldehyde gør vævet mere hydrofobisk.

Question 18

Kan formaldehyde og glutaraldehyde reagere med DNA og RNA?

Answer 18

Ja ved 65 grader for DNA og 45 grader for RNA

Question 19

Hvad er den kemiske formel for glutaraldehyde?

Answer 19

HCO-(CH2)3-CHO

Der er to aldehyde grupper adskilt af 3 methylene broer.

Question 20

Hvad gør at glutaraldehyde fixerer hurtigere end formaldehyde?

Answer 20

Glutaraldehyde er sammensat af polymerer, som har aldehyde grupper der stikker ud, som kan binde proteiner.

Question 21

Hvornår vil man undgå at fixerer med glutaraldehyde og hvornår vil man?

Answer 21

Hvis vævet skal bruges til imunnokemisk farvning og man vil bruge det til electron mikroskopi

Question 22

Hvad skal embedding bestå af, når man bruger glutaraldehyde?

Answer 22

Resin embedding media da det penetrerer bedre end paraffin.

Question 23

Hvad består Karnocsky´s fixative af, og hvad gør den?

Answer 23

1-4% glutaraldehyde i 2-4% formaldehyde.

Formaldehyde er hurtigt penetrerende og glutaraldehyde er hurtigt fixerende.

Question 24

Nævn nogle protein-denaturerings agenter

Answer 24

Ethanol og methanol

Methylated spirits

Question 25

Hvordan virker protein denaturerings agenter?

Answer 25

De ødelægger hydrofobiske bindinger i proteinet og ændrer dermed proteinets tertiære struktur.

Question 26

Hvornår vil man fixerer med alkoholer?

Answer 26

Cytologiske specimens
Frosne sections
Til antigen-antistof interventioner

Question 27

Et alkohol fixativ er alkohol blandet med PEG. Hvad går de to komponenter?

Answer 27

Alkohol fixerer cellerne
PEG laver et hydrofobisk lag omkring cellen, som beskytter den fra mekanisk skade og stopper ethanol blandingen og dermed forbygger at cellen tørre ud.

Question 28

Paraffin voks er hydrofobisk og fixativet er mest bestående af vand, som gør at der skal et mellemstep til før prøven kan behandles med paraffin. Forklar disse steps.

Answer 28

Vævet behandles med øget konc. af ethanol for at fjerne vandet fra fixativet.
Alkoholen erstattes af en clearing solution såsom xylene
Dette tillader embedding mediet til at erstatte Xylenet.

Question 29

Hvilken størrelse skal slides være ved paraffin embedding?

Answer 29

2-5 um.

Question 30

Når man gerne vil undersøge antigener i ens prøve er paraffin ikke den rigtig embedding metode, da de høje temperaturer gør at nogle antigener bliver beskadiget. Hvilken anden metode kan da bruges?

Answer 30

Fryse slidesene mde snap freeze.

Question 31

En af ulemperne ved snap freeze er at der kan dannes artefakter, når vævet føres ned i det flydende nitrogen. Hvordan kan man undgå dette?

Answer 31

Ved at fryse vævet i isopentane

Question 32

Væv udvider sig når det fryses ned så hurtigt, som kan give problemer med skæring af stykkerne. Hvordan kan man undgå dette?

Answer 32

Vævet skal optøs ved -20 grader før man skærer det.

Question 33

Beskriv de forskellige steps, når man bruger snap freeze, som embedding metoden.

Answer 33

Vævet føres ned i flydende nitrogen i isopentane
Herefter tøes vævet op til -20 grader og overføres til en cryostat med nedkølet pincetter.
Vævet føres over til et lag af OCT embedding medium i cryostaten, hvor der tilføres mere OCT omkring vævet. Det skal være frossen før man skærer.
Vævet kan skæres

Question 34

Hvilken størrelse bør vævs sektionerne være når man skærer væv der er blevet snap freezed og embedded i OCT?

Answer 34

5-10 um

Question 35

Hvad gør man hvis vævet er vandet, for at undgå artefakter i vævet?

Answer 35

Behandle vævet med en sucrose behandling i 18 timer

Question 36

Hvornår fixere man frosne vævs stykker og hvordan fixeres de?

Answer 36

Efter skæringen med alkohol

Question 37

Hvordan behandler man prøver (knogle, brystcancer biopsier) med calcium depoter?

Answer 37

Syre blandinger som:
Hydrochloric
Nitric
EDTA