Immunological methods Flashcards
Hvordan kompenserer IgM for sin lave affinitet?
Den er en pentamer og har derfor 10 bindingssteder, som kan binde til antigenet.
Hvordan adskiller man subklasser af antistoffer?
Ved deres heavy chains
Hvordan laves polyklonale antistoffer?
De laves af mange B-celler og er en kombination af immunglobuliner produceret mod en specifik antigen men mod forskellige epitoper.
Forklar kort stepsene for produktion af polyklonale antistoffer
Serum fra en art overføres til en anden.
Der gives en booser for øget affinitet
Der tages en blodprøve
Antistofferne kan isoleres.
Hvordan laves monoklonale antistoffer?
De produceres i enkelte B-celle kloner og er specifikke for en specifik epitop.
Beskriv stepsene for produktion af monoklonale antistoffer
Mus bliver injiceret med specifik antigen.
Milten på musen fjernes og B-cellerne isoleres
B-celler fra milten blandes med myeloma celler
Nogle af disse celler fusionerer for at danne hybrid celler
Cellerne overføres til et medie hvor kun hybrid celler kan overleve
Hybrid celler proliferer ind til hybridomas, som isoleres og kultireres
Hvad er myeloma celler?
Det er cancer B-celler der har mistet evnen til at producerer antistoffer
Hvad bruger man affinity chromatography til?
Oprensning af antistoffer eller antigener.
Beskriv stepsene for affinity chromatography
Antigen tilføjes til en rør
Serum eller supernatant køres gennem røret - inkuberes
Røret vaskes
En elution blanding tilføjes for at opløse bindingen af antistofferne som derefter kan opsamles.
Hvad består elution blanding ofte af?
Højt salt niveau eller lav pH
Beskriv stepsene for SDS-PAGE
Proteiner opvarmes med SDS, som gør dem negativt ladet og delvis denatureret.
Proteinerne tilføjes til membranen på gel-pladen
Strøm sættes til gelen og proteinerne vil vandre mod den positive.
Proteinernes størrelse kan derefter adskilles
Herefter kan gelen farves ved Western Blotting.
Beskriv hvordan Western Blotting fungerer
Man anvender en stærkt proteinabsorberende materiale, nitrocellulosepapir.
SDS-PAGE elektroforese polypeptiderne overeføres til dette papir ved et specielt elektroforese apparat.
Nitrocellulosepapiret kan herefter inkuberes med antistoffer for det protein man ønsker at finde.
Beskriv kort principperne bag multiplex measurements of fluorescent microbeads (Luminex)
Det fungere næsten som en ELISA.
Man har en brøndplade som indeholder beads der er coated med forskellige antistoffer, således at brønd 1 kan opfange IL-1 og brønd 2 kan opfange IL2.
Man tilsætter sin prøve til de brønde, hvor man ønsker at undersøge om cellerne har produceret nogle specifikke cytokiner.
Herefter tilføres der et detection antistof, som binder til cytokinet
Herefter tilsætter man et substrat som vil flouroscerer.
Prøverne bliver derefter kort igennem et flowcytometer eller en luminex.
Man vil både se farve fra beadsene og fra detection antistof med substrat.
