Immunohistochemistry

Question 1

Før farvning af prøven skal paraffin fjernes, hvilke step indebærer det?

Answer 1

Dewaxing paraffinen.
Xylene tilføres i høje mængder
Halv Xylene med halv ethanol tilføres
Ethanol tilføres i høje mængder for at dehydrerer prøven.
Prøven vaskes herefter med vand for hydrere prøven igen.

Question 2

Hvilke steps skal man igennem inden farvning hvis prøven er embedded i paraffin?

Answer 2

Paraffin fjernelse 
Antigen retrieval 
Permeabilisering 
Blokering 
Antistof inkubering 
Mounting

Question 3

Hvilke steps skal man igennem inden farvning hvis prøven er embedded med OCT?

Answer 3

Permeabilisering
Blokering
Antistof inkubering
Mounting

Question 4

Paraffin embedding kan lave nogle skader på epitoper, som kan forbedres ved en metode kaldet antigen retrieval. Hvad gør at epitoperne er mere tilstede til binding af antistoffer?

Answer 4

Man bryder methylene broerne der er mellem proteinerne, så de laver en mere teriær struktur, som gør at antistoffer bedre kan komme til.

Question 5

Nævn de to antigen retrieval metoder

Answer 5

Heat induced epitope retrieval (HIER)

Proteolytic-induced epitope retrieval (PIER)

Question 6

Hvis ens antigen ligger intracellulært skal vævet permeabiliseres så antistofferne kan komme ind i cellen. Hvilke agenter kan da bruges?

Answer 6

Acetone
Triton x-100 i 10-15 min
Sapanin 15-30 min
Sodium dodecyl sulfate (SDS)

Question 7

Hvordan fungerer disse permeabiliserings agenter?

Answer 7

De sætter sig i cellemembranen, som leder til at porer laves.

Question 8

Nævn de overordnet formål med farvning

Answer 8

At gøre strukturer synlige
Vise variation i strukturer
Indikering af den kemiske natur af et vævs struktur.

Question 9

Hvordan kan farvning foregå, hvilke to metoder kan man farve med?

Answer 9

Direkte kemiske binding: Farve til væv

Indirekte binding: Farve-mordant-væv

Question 10

Hvordan virker en mordant?

Answer 10

Som en hjælper hvis en farve ikke kan binde direkte til vævet fungerer mordanten som et mellemled der kan binde både farven og vævet.

Question 11

Nævn nogle basofile farver

Answer 11

Toluidine blå
Methylen blå
Hæmatoxylin
Alcian blå

Question 12

Hvilke celle strukturer farver basofile farver?

Answer 12

Nucleinsyre
rRNA og rER
Glycosaminoglykaner
Glycoproteiner

Question 13

Nævn nogle acidofile farver

Answer 13

Orange
Eosin
Acid fucshin

Question 14

Hvilke celle strukturer farver acidofile farver?

Answer 14

Mitokondria
Cytoplasma
Sekretoriske granula
ECM proteiner

Question 15

Hvilke strukturer farver Masson´s Trichrome?

Answer 15

Kollagen i det ekstracellulære matrix. Bruges til identificerer fibrose.
Cytoplasma = rød
Kollagen = blå

Question 16

Hvilke strukturer farver Periodic acid-Schiff (PAS)?

Answer 16

Farver glykogen, mucin og basalmembranen.

Question 17

Nævn de dyes der findes til lipid staining

Answer 17

Oil red O
Sudan IV
Sudan black

Question 18

Hvornår bruger man lipid staining?

Answer 18

Bruges i frosne slides da lipider er bevaret, til at se dem i lysmikroskop.

Question 19

Hvornår bruger man counterstaining?

Answer 19

Til at visualiserer nuclær detaljer efter immunokemisk farvning.

Question 20

Hvad hedder de to typer af grupper som counterstains kan klassificeres ind i?

Answer 20

Tinctorial

Fluorescent

Question 21

Hvad kunne mordanter være, for f.eks. hæmatoxylin kan binde til kromatin?

Answer 21

Salt
Iron 
Aluminium 
Tungset 
Bly

Question 22

Hvad er mounting?

Answer 22

Det er metoden til at få et tyndt glas til at sidde ned over et stykke væv.

Question 23

Hvorfor bruger man mounting medium?

Answer 23

For at beskytte prøven og den immunhistokemiske farvning fra fysiske skader.
Hjælper til at forbedre klarheden og kontrast af billedet
Forhindre fading af flourophore.

Question 24

Hvilke karakteristisk skal mounting mediet have?

Answer 24

Være farveløs og transperant
Være gennemtrængelig og fylde vævesmellemrummene
Må ikke skade vævet
Forhindre bakteriel kontamination
Beskytte vævet og farve fra mekaniske og kemiske skader (oxidering og pH)
Skal kunne blandes med dehydrant og clearing agenten.
Må ikke krystalliserer, revne eller skrumpe vævet
Dens refractive index bør være så tæt på det fixede væv som muligt.

Question 25

Hvordan tester man om den metode man har brugt er god?

Answer 25

Ved en negativ og positiv kontrol

Question 26

Hvad tester den positive kontrol og hvad tester man på?

Answer 26

Man tester for den primære antistof specificitet.
Derfor består den positive kontrol af væv eller celler som man ved udtrykker det antigen man gerne vil have at antistoffet binder til.

Question 27

Hvad tester den negative kontrol og hvad tester man på?

Answer 27

Man tester for metodens specificitet.
Hvis man bruger et sekundært antistof kan den fungerer som negativ kontrol så man tester om den binder uspecifikt.
Andre negative kontroller kan være autofluorescence.

Question 28

Hvad bruger immunoenzym metoder?

Answer 28

Bruger enzymer til at farve væv

Question 29

Hvad bruger immunofluorescence metoder til at farve?

Answer 29

Antistoffer

Question 30

Nævn nogle immunoenzym metoder

Answer 30

Direkte farvning
Indirekte
Peroxidase-antiperoxidase (PAP)
Hapten-PAP

Question 31

Hvornår bruger man blocking?

Answer 31

Når man ønsker at eliminerer baggrunds farve og derved falske positive farver.

Question 32

Nævn nogle agenter der fungerer som blocking for nonspecifik adsorption

Answer 32

Normal serum
Non-fat dry milk
BSA
Commersial blicking buffers.

Question 33

Nævn nogle agenter der fungerer som blocking for endogenous substanser

Answer 33

Biotin 
hydrogen Peroxidase (3%)