Immunohistochemistry Flashcards
Før farvning af prøven skal paraffin fjernes, hvilke step indebærer det?
Dewaxing paraffinen.
Xylene tilføres i høje mængder
Halv Xylene med halv ethanol tilføres
Ethanol tilføres i høje mængder for at dehydrerer prøven.
Prøven vaskes herefter med vand for hydrere prøven igen.
Hvilke steps skal man igennem inden farvning hvis prøven er embedded i paraffin?
Paraffin fjernelse Antigen retrieval Permeabilisering Blokering Antistof inkubering Mounting
Hvilke steps skal man igennem inden farvning hvis prøven er embedded med OCT?
Permeabilisering
Blokering
Antistof inkubering
Mounting
Paraffin embedding kan lave nogle skader på epitoper, som kan forbedres ved en metode kaldet antigen retrieval. Hvad gør at epitoperne er mere tilstede til binding af antistoffer?
Man bryder methylene broerne der er mellem proteinerne, så de laver en mere teriær struktur, som gør at antistoffer bedre kan komme til.
Nævn de to antigen retrieval metoder
Heat induced epitope retrieval (HIER)
Proteolytic-induced epitope retrieval (PIER)
Hvis ens antigen ligger intracellulært skal vævet permeabiliseres så antistofferne kan komme ind i cellen. Hvilke agenter kan da bruges?
Acetone
Triton x-100 i 10-15 min
Sapanin 15-30 min
Sodium dodecyl sulfate (SDS)
Hvordan fungerer disse permeabiliserings agenter?
De sætter sig i cellemembranen, som leder til at porer laves.
Nævn de overordnet formål med farvning
At gøre strukturer synlige
Vise variation i strukturer
Indikering af den kemiske natur af et vævs struktur.
Hvordan kan farvning foregå, hvilke to metoder kan man farve med?
Direkte kemiske binding: Farve til væv
Indirekte binding: Farve-mordant-væv
Hvordan virker en mordant?
Som en hjælper hvis en farve ikke kan binde direkte til vævet fungerer mordanten som et mellemled der kan binde både farven og vævet.
Nævn nogle basofile farver
Toluidine blå
Methylen blå
Hæmatoxylin
Alcian blå
Hvilke celle strukturer farver basofile farver?
Nucleinsyre
rRNA og rER
Glycosaminoglykaner
Glycoproteiner
Nævn nogle acidofile farver
Orange
Eosin
Acid fucshin
Hvilke celle strukturer farver acidofile farver?
Mitokondria
Cytoplasma
Sekretoriske granula
ECM proteiner
Hvilke strukturer farver Masson´s Trichrome?
Kollagen i det ekstracellulære matrix. Bruges til identificerer fibrose.
Cytoplasma = rød
Kollagen = blå
Hvilke strukturer farver Periodic acid-Schiff (PAS)?
Farver glykogen, mucin og basalmembranen.
Nævn de dyes der findes til lipid staining
Oil red O
Sudan IV
Sudan black
Hvornår bruger man lipid staining?
Bruges i frosne slides da lipider er bevaret, til at se dem i lysmikroskop.
Hvornår bruger man counterstaining?
Til at visualiserer nuclær detaljer efter immunokemisk farvning.
Hvad hedder de to typer af grupper som counterstains kan klassificeres ind i?
Tinctorial
Fluorescent
Hvad kunne mordanter være, for f.eks. hæmatoxylin kan binde til kromatin?
Salt Iron Aluminium Tungset Bly
Hvad er mounting?
Det er metoden til at få et tyndt glas til at sidde ned over et stykke væv.
Hvorfor bruger man mounting medium?
For at beskytte prøven og den immunhistokemiske farvning fra fysiske skader.
Hjælper til at forbedre klarheden og kontrast af billedet
Forhindre fading af flourophore.
Hvilke karakteristisk skal mounting mediet have?
Være farveløs og transperant
Være gennemtrængelig og fylde vævesmellemrummene
Må ikke skade vævet
Forhindre bakteriel kontamination
Beskytte vævet og farve fra mekaniske og kemiske skader (oxidering og pH)
Skal kunne blandes med dehydrant og clearing agenten.
Må ikke krystalliserer, revne eller skrumpe vævet
Dens refractive index bør være så tæt på det fixede væv som muligt.
Hvordan tester man om den metode man har brugt er god?
Ved en negativ og positiv kontrol
Hvad tester den positive kontrol og hvad tester man på?
Man tester for den primære antistof specificitet.
Derfor består den positive kontrol af væv eller celler som man ved udtrykker det antigen man gerne vil have at antistoffet binder til.
Hvad tester den negative kontrol og hvad tester man på?
Man tester for metodens specificitet.
Hvis man bruger et sekundært antistof kan den fungerer som negativ kontrol så man tester om den binder uspecifikt.
Andre negative kontroller kan være autofluorescence.
Hvad bruger immunoenzym metoder?
Bruger enzymer til at farve væv
Hvad bruger immunofluorescence metoder til at farve?
Antistoffer
Nævn nogle immunoenzym metoder
Direkte farvning
Indirekte
Peroxidase-antiperoxidase (PAP)
Hapten-PAP
Hvornår bruger man blocking?
Når man ønsker at eliminerer baggrunds farve og derved falske positive farver.
Nævn nogle agenter der fungerer som blocking for nonspecifik adsorption
Normal serum
Non-fat dry milk
BSA
Commersial blicking buffers.
Nævn nogle agenter der fungerer som blocking for endogenous substanser
Biotin hydrogen Peroxidase (3%)
