Fluorescence and confocal microscopy

Question 1

Nævn nogle exciter filter

Answer 1

Ultraviolet glass (UG)
Blue glass (BG)
Short pass filters 
Band pass filter (BP)

Question 2

Hvad er funktionen af exctier filters?

Answer 2

De tillader kun udvalgte bølgelængder at passerer gennem prøven.

Question 3

Hvad er funktionen af barrier filters?

Answer 3

Blokerer korte bølgelængder og tillader passage af længere bølgelængder:
Tillader blokering af de exciterede bølgelængder og tillader kun passage af udvalgte emissions bølgelængder.

Question 4

Hvad er funktionen af Dicromatic beamsplitters (dichroic mirrors)?

Answer 4

Reflekterer korte bølgelængder og emitterer lange bølgelængder.
Reflekterer excitations bølgelængder og tillader passage af emissions bølgelængder.

Question 5

Hvad er funktionen af interference filters?

Answer 5

Tillader passage af meget selektive bølgelængder, så man således undgår bleedthrough. De er placeret i barrier filters.

Question 6

Beskriv opbygningen af bandpass sektionen af et interference filter

Answer 6

Substrate 
Stack 
Spacer 
Simplest period 
Absentee layer 
Simplest period
Spacer 
Stack

Question 7

How can bleedthrough be reduced?

Answer 7

By using optimized fluorescence filter sets and set the intensity low if there are any bleedthrough.

Question 8

What will happen if there are a bleeadthrough?

Answer 8

Hvis man farver således at man ønsker at visualiserer to strukturer, men at intensiteten for den flourephore overlapper med intensiteten for den anden, f.eks. grøn og rød (som ligger tæt i spektret), hvis man ikke har indstillet den røde intensitet smalt nok, vil den også farve der hvor den grønne intensitet er til stede. Derved vil den grønne farve i et merged billede blive gult.

Question 9

Hvad er fordelene ved quantum dots?

Answer 9

Deres absorptions spektrum øges og sænkes ens.
Emissionen er begrænset til et symmetrisk peak med en max bølgelængde der er afhængig af størrelsen på dotten og ikke bølgelængden af excitationen.

Question 10

Hvad er photobleaching?

Answer 10

En process hvor fluorephore mister deres evne til at fluorecherer som resulterer i i en fading af signalet.

Question 11

Hvornår sker photobleaching?

Answer 11

Når fluorophorer reagerer med hinanden med permanent kovalent binding.

Question 12

Hvad kan photobleaching lede til?

Answer 12

Falsk negative resultater

Question 13

Hvilke teknikker kan bruges til at reducerer photobleaching?

Answer 13

Bruge forskellige farver
Reducerer bright light
Reducerer eksponeringen af prøven til lyset
Bruge et antifade medium (mere besværgligt)
FRAP
Farve i kombination med DIC mikroskopi

Question 14

Hvad er Stokes shift?

Answer 14

Spektret mellem exctitation spektret og emission spektret, som kan være langt eller kort

Question 15

Hvad går fluorescence ud på rent antom mæssigt?

Answer 15

Elektroner bliver opfanget og der sendes photoner ud, som kan opfanges

Question 16

Hvad gør den semi-reflective coating i interference filters?

Answer 16

Den fjerner destructive interference, da de bliver reflekteret væk, og lader constructive interference komme igennem. Dette kan producenten selv designe.

Question 17

Hvordan tilpasser man emission filter til ens flourophore?

Answer 17

Man tilpasser filters således at man opfanger mest muligt emitteret photons.
Dette må man gå på kompromis med hvis man farver med flere flourophorer, da de kan overlappe i hinandens spektre.

Question 18

Hvad er fordelene ved at bruge confocal microscopy?

Answer 18

Man kan få mange flere detaljer med på tykkere stykker af prøver (2 mikrometer)

Question 19

Hvad er essensen bag confocal microscopy?

Answer 19

at fjerne out of focus light.

Question 20

Hvad gør detectoren i confocal microscopy?

Answer 20

Den forstærker photon signalet ved hjælp af spejle.

Question 21

Hvad er ulemperne ved et confocal microscopy?

Answer 21

Den er langsom til at lave billedet, da den scanner spot by spot.
Den har lav effeciency pga. PMT´en, hvor nogle photoner går tabt.