Electrophysiological methods Flashcards
Hvad består ion kanaler af?
Makromolekyler
Hvad kontrollerer ion kanaler?
Ion flowet mellem plasmamembranen af intracellulære organeller.
Hvilke fysiologiske funktioner er ion kanalerne essentielle i?
Kognition Sensorisk Muskel kontraktioner Volume regulation Cellulære signaler
Hvilke sygdomme kan medfødte defekter i ion kanaler medfører?
Epilepsi
Arrytmier
Myotonia
Hvordan kan åbning og lukning af ion kanaler reguleres?
Strøm Temperatur Osmolaritet Mekanisk styrke Binding af kemiske ligander
Hvad bruger man ion channel research til?
Deres rolle i sundhed og sygdom
Farmakoterapi
Lægemiddel screening
På hvad kan man anvende manual patch clamp teknik?
Celler
Primære og stam celle deriveret celler
Vævstykker
Hvad kan man bruge manual patch clamp teknikken til at undersøge?
Funktionen af komponenter
Bestemme effekten af komponenter på den biofysiske fordeling af kanaler
Sikkerhedsvurdering i lægemiddeludvikling og lede til optimisering.
Hvilke elektroder bruges i manual patch clamp?
Borosilicate elektroder
Beskriv kort udførelsen af single-channel manual patch clamp teknikken?
Optagelsen sker via elektroder.
En pipette som indeholder elektrolytter er forseglet til membranen og isolerer en del af membranen (patch) elektrisk.
Strømme der kommer ud af kanaler i patchen føres ind i pipetten og kan herved blive optaget af elektroden, som er sat op til en amplifier.
Pipette spidsen laver en giga-ohm forsegling til cellemembranen.
Optagelse af denne strøm gør at man kan se ledningstrømmen af membranen.
Hvad kan man undersøge ved whole patch recording?
Flere ion kanaler på en gang.
Man kan undersøge lægemidlers effect real time
Hvordan etableres whole cell patch?
Ved ødelægge membranen ved at suge den.
En høj pulsering af strømmen.
Hvad er fordelen og ulemper ved whole cell patch?
Fordele: Den større åbning der nu er tilstede gør at modstanden er mindre og der er derved bedre elektrisk adgang til cellen intracellulært.
Ulemper: Dialyszing: Da pipettens volumen er større end cellens, vil cellens indre langsomt blive af erstattes af indholdet fra pipetten.
Hvordan er dialyzing af cellen reduceret i whole cell patch?
Man forsøger at efterligne høje kalium miljø inde i cellen.
Hvad er inside-out patch?
Det er en metode hvor et stykke af celle membranen med ion kanaler fjernes fra resten af cellen, således at den intracellulære overflade af membranen er i kontakt med det omliggende miljø.
Hvad er fordele ved inside-out patch?
Man kan styrer hvilke kemikalier indersiden af membranen bliver eksponeret til. Dette er brugbart for ligan ion kanaler som styres af intracellulære ligander. Herved kan man undersøge forskellige koncentrationer af ligander og deres påvirkning af kanalerne.
Når cellemembraner bliver ødelagt vil de fusionerer hurtigt igen. I inside-out patch teknikken ønsker man ikke at den del af membranen som er på pipetten fusionerer. Hvilke metoder kan bruges for at undgå dette?
Hurtig eksponerer membranen til bath solution eller en lav calcium solution.
Eller tilføje en dråbe paraffin eller silicone polymer.
Hvad er teknikken bag outside-out patch?
Det er først at lave whole cell patch. Herefter trækkes pipetten tilbage indtil stykker af membranen rives løst, som vil fusionerer og danne en bubbel for enden af pipetten.
Hvad kan man undersøge ved outside-out teknikken?
Ion kanalers påvirkning af det ekstracellulære miljø.
Hvad er pipette-based automatic patch-clamp system?
Denne teknik efterligner den manuelle patch-clamp teknik bare hvor selve patchen er gjort af en computer. Den laver single-channel og whole cell recording.
Beskriv hvordan pipette-based automatic patch-clamp system bliver udført
Der er en recording pipette og en catching pipette.
Celler bliver frigivet til brønden med pipetterne.
Catch pipetten opfanger en celle, som kan bliver undersøgt eller frigivet igen, hvis den ikke er god nok.
Recording pipetten fastspænder sig cellemembranen og laver enten single-channel eller whole cell konfiguration.
Catch pipetten slipper cellen og recording pipetten bevæger sig væk og starter recording.
Fordele ved pipette-based automatic patch-clamp system?
Simpel teknik Hurtig og pålidelig Høj data kvalitet Visuelt identifikation af celler Hurtig skift til manuelt
Ulemper ved pipette-based automatic patch-clamp system?
Lav throughput
Nævn typer af planar electrode methods der findes?
IonWorks HT
QPatch
Patchliner
Hvor mange brønde kan kører parallelt og hvor mange celler kan analyseres pr. brønd i en patchliner?
2, 4 eller 8 brønde kan kører parallelt
1 celle/brønd
Hvor mange brønde kan kører parallelt og hvor mange celler kan analyseres pr. brønd i en QPatch?
16 eller 48 brønde kan kører parallelt
1 celle/brønd
Hvor mange brønde kan kører parallelt og hvor mange celler kan analyseres pr. brønd i en IonWorks HT?
384 brønde hvor 48 kan kører sekventielt.
1 celle/brønd
Hvilken type patch clamp udfører IonWorks HT?
Whole cell voltage-clamp recording af ion kanaler.
Hvad kan planar electrode methods bruges til?
Undersøgelser af lægemidlers påvirkning af ion kanaler
Hvorfor er specielt planar electrode methods gode?
De har et højt throughput.
Man kan teste mange cellekulturer på en gang og med forskellige lægemidler.
Derudover undgår man nogle bias, da efterforskeren ikke udvælger celler.
Hvordan overføres celler til brøndene i IonWorks HT?
Ved hjælp af en 12-channel pipittor.
Beskriv kort hvordan QPatch udfører patch clamp?
48 brøndpladen overføres recording området.
Intracellulær væske overføres til brøndende
Herefter tilføres der et låg (recording manifold) på pladen
Extracellulær væske tilføres brøndene
Cellerne bliver i maskinen centrifugeret ned og resuspenderet i extracellulær væske, før de føres over i brøndene
En celle fanges af patch clamp i brøndene vha. gigaohm seal
Først testes baseline for ion kanalerne herefter tilføjer man sine test komponenter.
Herefter laver softwaren forskellige fremvisninger af resultatet.
Hvad er fordelen ved glas overflader frem for plastic i planar array patch methods?
Komponenter har nemmere ved at binde til plastic end glas. Dette leder til bedre dosis response
Hvilke parametre sammenligner man automated patch clamp devices?
Throughput Seal resistance Single cell or population clamp External/internal perfusion Multiple compound addition / wash of capacity Temperature control Cost
Hvile typer af celler er elektriske aktive og kan derfor undersøges med MEA?
Hjerteceller
Retina
Muskel
Neuroner
Forklar hvordan MEA virker
Brønden på en cellekultur er monteret med elektroder, som kan opfange aktionpotentialer, som vil vise sig som spikes på en monitor.
Hvad er MEA god til at undersøge?
Aktiviteten af cellekulturer og dermed undersøge network behavior. Derved kan man karakteriserer cellekulturer, se på deres udvikling, sygdom eller screening af lægemiddel sikkerhed og effektivitet.
Hvad er det nuværende udfordringer med automated patch clamp methods?
Tilbyder ikke tilstrækkeligt throughput til at kunne bruge det som et primært værktøj for high-throughput screening
Det er dyrt
Kræver specialiserede personale
Kvalitetskontrol og analyse af store mængder data er en udfordring.
