Electrophysiological methods

Question 1

Hvad består ion kanaler af?

Answer 1

Makromolekyler

Question 2

Hvad kontrollerer ion kanaler?

Answer 2

Ion flowet mellem plasmamembranen af intracellulære organeller.

Question 3

Hvilke fysiologiske funktioner er ion kanalerne essentielle i?

Answer 3

Kognition
Sensorisk 
Muskel kontraktioner 
Volume regulation
Cellulære signaler

Question 4

Hvilke sygdomme kan medfødte defekter i ion kanaler medfører?

Answer 4

Epilepsi
Arrytmier
Myotonia

Question 5

Hvordan kan åbning og lukning af ion kanaler reguleres?

Answer 5

Strøm 
Temperatur 
Osmolaritet 
Mekanisk styrke 
Binding af kemiske ligander

Question 6

Hvad bruger man ion channel research til?

Answer 6

Deres rolle i sundhed og sygdom
Farmakoterapi
Lægemiddel screening

Question 7

På hvad kan man anvende manual patch clamp teknik?

Answer 7

Celler
Primære og stam celle deriveret celler
Vævstykker

Question 8

Hvad kan man bruge manual patch clamp teknikken til at undersøge?

Answer 8

Funktionen af komponenter
Bestemme effekten af komponenter på den biofysiske fordeling af kanaler
Sikkerhedsvurdering i lægemiddeludvikling og lede til optimisering.

Question 9

Hvilke elektroder bruges i manual patch clamp?

Answer 9

Borosilicate elektroder

Question 10

Beskriv kort udførelsen af single-channel manual patch clamp teknikken?

Answer 10

Optagelsen sker via elektroder.
En pipette som indeholder elektrolytter er forseglet til membranen og isolerer en del af membranen (patch) elektrisk.
Strømme der kommer ud af kanaler i patchen føres ind i pipetten og kan herved blive optaget af elektroden, som er sat op til en amplifier.
Pipette spidsen laver en giga-ohm forsegling til cellemembranen.
Optagelse af denne strøm gør at man kan se ledningstrømmen af membranen.

Question 11

Hvad kan man undersøge ved whole patch recording?

Answer 11

Flere ion kanaler på en gang.

Man kan undersøge lægemidlers effect real time

Question 12

Hvordan etableres whole cell patch?

Answer 12

Ved ødelægge membranen ved at suge den.

En høj pulsering af strømmen.

Question 13

Hvad er fordelen og ulemper ved whole cell patch?

Answer 13

Fordele: Den større åbning der nu er tilstede gør at modstanden er mindre og der er derved bedre elektrisk adgang til cellen intracellulært.
Ulemper: Dialyszing: Da pipettens volumen er større end cellens, vil cellens indre langsomt blive af erstattes af indholdet fra pipetten.

Question 14

Hvordan er dialyzing af cellen reduceret i whole cell patch?

Answer 14

Man forsøger at efterligne høje kalium miljø inde i cellen.

Question 15

Hvad er inside-out patch?

Answer 15

Det er en metode hvor et stykke af celle membranen med ion kanaler fjernes fra resten af cellen, således at den intracellulære overflade af membranen er i kontakt med det omliggende miljø.

Question 16

Hvad er fordele ved inside-out patch?

Answer 16

Man kan styrer hvilke kemikalier indersiden af membranen bliver eksponeret til. Dette er brugbart for ligan ion kanaler som styres af intracellulære ligander. Herved kan man undersøge forskellige koncentrationer af ligander og deres påvirkning af kanalerne.

Question 17

Når cellemembraner bliver ødelagt vil de fusionerer hurtigt igen. I inside-out patch teknikken ønsker man ikke at den del af membranen som er på pipetten fusionerer. Hvilke metoder kan bruges for at undgå dette?

Answer 17

Hurtig eksponerer membranen til bath solution eller en lav calcium solution.
Eller tilføje en dråbe paraffin eller silicone polymer.

Question 18

Hvad er teknikken bag outside-out patch?

Answer 18

Det er først at lave whole cell patch. Herefter trækkes pipetten tilbage indtil stykker af membranen rives løst, som vil fusionerer og danne en bubbel for enden af pipetten.

Question 19

Hvad kan man undersøge ved outside-out teknikken?

Answer 19

Ion kanalers påvirkning af det ekstracellulære miljø.

Question 20

Hvad er pipette-based automatic patch-clamp system?

Answer 20

Denne teknik efterligner den manuelle patch-clamp teknik bare hvor selve patchen er gjort af en computer. Den laver single-channel og whole cell recording.

Question 21

Beskriv hvordan pipette-based automatic patch-clamp system bliver udført

Answer 21

Der er en recording pipette og en catching pipette.
Celler bliver frigivet til brønden med pipetterne.
Catch pipetten opfanger en celle, som kan bliver undersøgt eller frigivet igen, hvis den ikke er god nok.
Recording pipetten fastspænder sig cellemembranen og laver enten single-channel eller whole cell konfiguration.
Catch pipetten slipper cellen og recording pipetten bevæger sig væk og starter recording.

Question 22

Fordele ved pipette-based automatic patch-clamp system?

Answer 22

Simpel teknik 
Hurtig og pålidelig 
Høj data kvalitet 
Visuelt identifikation af celler 
Hurtig skift til manuelt

Question 23

Ulemper ved pipette-based automatic patch-clamp system?

Answer 23

Lav throughput

Question 24

Nævn typer af planar electrode methods der findes?

Answer 24

IonWorks HT
QPatch
Patchliner

Question 25

Hvor mange brønde kan kører parallelt og hvor mange celler kan analyseres pr. brønd i en patchliner?

Answer 25

2, 4 eller 8 brønde kan kører parallelt

1 celle/brønd

Question 26

Hvor mange brønde kan kører parallelt og hvor mange celler kan analyseres pr. brønd i en QPatch?

Answer 26

16 eller 48 brønde kan kører parallelt

1 celle/brønd

Question 27

Hvor mange brønde kan kører parallelt og hvor mange celler kan analyseres pr. brønd i en IonWorks HT?

Answer 27

384 brønde hvor 48 kan kører sekventielt.

1 celle/brønd

Question 28

Hvilken type patch clamp udfører IonWorks HT?

Answer 28

Whole cell voltage-clamp recording af ion kanaler.

Question 29

Hvad kan planar electrode methods bruges til?

Answer 29

Undersøgelser af lægemidlers påvirkning af ion kanaler

Question 30

Hvorfor er specielt planar electrode methods gode?

Answer 30

De har et højt throughput.
Man kan teste mange cellekulturer på en gang og med forskellige lægemidler.
Derudover undgår man nogle bias, da efterforskeren ikke udvælger celler.

Question 31

Hvordan overføres celler til brøndene i IonWorks HT?

Answer 31

Ved hjælp af en 12-channel pipittor.

Question 32

Beskriv kort hvordan QPatch udfører patch clamp?

Answer 32

48 brøndpladen overføres recording området.
Intracellulær væske overføres til brøndende
Herefter tilføres der et låg (recording manifold) på pladen
Extracellulær væske tilføres brøndene
Cellerne bliver i maskinen centrifugeret ned og resuspenderet i extracellulær væske, før de føres over i brøndene
En celle fanges af patch clamp i brøndene vha. gigaohm seal
Først testes baseline for ion kanalerne herefter tilføjer man sine test komponenter.
Herefter laver softwaren forskellige fremvisninger af resultatet.

Question 33

Hvad er fordelen ved glas overflader frem for plastic i planar array patch methods?

Answer 33

Komponenter har nemmere ved at binde til plastic end glas. Dette leder til bedre dosis response

Question 34

Hvilke parametre sammenligner man automated patch clamp devices?

Answer 34

Throughput 
Seal resistance 
Single cell or population clamp 
External/internal perfusion 
Multiple compound addition / wash of capacity 
Temperature control 
Cost

Question 35

Hvile typer af celler er elektriske aktive og kan derfor undersøges med MEA?

Answer 35

Hjerteceller
Retina
Muskel
Neuroner

Question 36

Forklar hvordan MEA virker

Answer 36

Brønden på en cellekultur er monteret med elektroder, som kan opfange aktionpotentialer, som vil vise sig som spikes på en monitor.

Question 37

Hvad er MEA god til at undersøge?

Answer 37

Aktiviteten af cellekulturer og dermed undersøge network behavior. Derved kan man karakteriserer cellekulturer, se på deres udvikling, sygdom eller screening af lægemiddel sikkerhed og effektivitet.

Question 38

Hvad er det nuværende udfordringer med automated patch clamp methods?

Answer 38

Tilbyder ikke tilstrækkeligt throughput til at kunne bruge det som et primært værktøj for high-throughput screening
Det er dyrt
Kræver specialiserede personale
Kvalitetskontrol og analyse af store mængder data er en udfordring.