Prepareringsmetoder för EM Flashcards
Vilka krav måste vi ställa på vårt preparat för att kunna mikroskopera i TEM?
- vakuum –> för dehydrering
- e- transmission –> för tunnsnittning
- e- osynlig –> för kontrastering
- Högspänning –>för stabiliteten
Vad är det för vävnadspreparering som behövs göras vid TEM?
- Fixering
- Dehydrering
- Inbäddning
- Snittning
- Kontrastering
- mikroskopering
Vad finns det för olika fixeringar man kan göra?
- Fysikalisk fixering: ex, frysning
- Kemisk fixering: ex, lämplig jonsammansättning, lämplig osmolaritet, förmåga att bibehålla konstant pH-värde.
Hur fungerar kemisk fixering ?
- -> dubbelfixering av små vävnadsbitar
- “primärfixering”: formaldehyd, glutaraldehyd, vanligt med kombinationsfixering bestående av dem ovanför.
- “postfixering”: osmium (?)
Vad är dehydrering ?
- organiska lösningsmedel:
tex. etanol, metanol, aceton, propylenoxid - i stigande koncentrationer: ( 30%-50%) …
Vad är det för krav vid inbäddning av härdplast ?
- Låg viskositet
- uniform polymerisering (härdning)
- ingen volymförändring
- lämplig hårdhet
- stabil och jämn kvalitet
Vad består härdplast utav? vilket kan vara fördelar/nackdelar
- Epoxyplast:
fördel= krymper 2%, jämn polymerisering, stabil i e- strålen
nackdel= hydrofob, polymeriserar i värme (60C) - Akrylatplast:
fördel= hydrofil, lågviskös, polymeriseras både i rumstemperatur / minus grader
nackdel= krymper 10-20%, ojämn polymerisering, mindre stabil i e- strålen
Hur snittas preparatet ?
- ultramikrotom
- glas- eller diamantkniv
- ev. LM-snittning 0.5-1 um tjock snitt på objektsglaset som färgas med ex. Richardsson.
- EM snittning 60-70nm
Hur fungerar kontrastering ?
Grids med ultratunna snitt utsätts för lösningar av tungmetaller, ex. bly.
Detta för att öka effekten av den elastiska avlänkning
Hur fungerar svepelektronmikroskop SEM?
- Används för att titta på preparatets ytstruktur
- Preparat upp till flera centimeters storlek
- Preparatet måste vara torrt eftersom mikroskopet arbetar i högvakuum.
- Preparatets yta beläggs ofta med tungmetaller för att öka den sekundära stålningen
- Konduktiv montering, dvs preparatet sitter fast på metallen (jordat). Om inte, kan man få överslag i mikroskopet.
Hur går vävnadspreparering till vid SEM?
- -> Primärfixering: aldehydfixering
- Kan använda postfixering “osmium”
- Dehydrering: innebär stigande koncentration av etanol.
- Torkning
- Konduktiv montering
Hur sker immunhistokemi inför TEM?
Problem: antigen-epitoperna förstörs av traditionellt TEM-preparering.
- Kompromiss mellan att behålla antigeniciteten och go morfologi
- Krävs god planering för att bestämma metod
Val av metod: vilka metoder finns?
- Pre-embedding: immunoinkubering innan postfixering, dehydrering och inbäddning.
- Post-embeddning: immunoinkubering görs på platsinbäddning snitt (akrylatplast)
- Kryosnittning: vid ca -100 grader. Snitt inkuberas och inbäddas därefter i methylcellulosa.
Vad ska det vara för fixering vid immunoTEM?
Kemisk fixering= lägre koncentration och och kortare tid.
Frysning= utan att de bildas kristaller
Vad innebär PLT-metoden ?
Kemisk “lättfixering”
- Dehydrering med etanol under progressiv temperatursänkning -30 till -50 grader)
- Inbäddning i akrylplast vid -30 til, -50 grader
- Polymerisering med UV-ljus
- Snittning i rumstemperatur
