Morfologisk Metodik 2 (färgning) Flashcards
Varför används visualiseringsmetoder/ färgningsmetoder ?
Skapa kontrast i den
mikroskopiska bilden genom att
ändra ljusbrytningen.
Hur kan man på olika sätt färga ett preparat ?
•Färgmolekyler - färgning, histokemi •Metaller - impregnering •DNA -prober - in situ hybridisering
•Antikroppar
- immunohistokemi
•Fluorescerande ämnen
- immunofluorescence
•Enzymer
- enzymhistokemi
•Isotoper
- autoradiografi
•Faskontrast
- faskontrastmikroskopi
Hur många olika färgmolekyler finns det ?
•Det finns 361 olika färgmolekyler för histologi
(enligt StainFiles)
–> + metaller (brunt, grått, svart)
Varför gillar olika vävnadskomponenter olika färgmolekyler ?
Beror på olika kemiska
bindningar mellan
vävnadskomponenter
och färg/metaller
Vad innebär översiktsfärgning och specialfärgning?
•Översiktsfärgning – Cellkärnor kontra cytoplasma - Htx-eosin •Specialfärgning – En mer detaljerad bild av vävnadens uppbyggnad (bindväv, elastiska fibrer, viruspartiklar, svamp osv.) - Specialfärgning för TBC-bakterier; Ziehl-Neelsen
Det finns naturliga färgämnen, vilka är det?
•Naturliga färgämnen: hämtade ur naturen processade och renframställda - Hematoxylin (trädbark från Kampeschträd) –Saffranin (krokus) – Karmin (sköldlus) •Syntetiska färgämnen: framställda ur stenkolstjära – De allra flesta andra
Hur fungerar färgämnens bindning till vävnader?
• Färgämnen dissocierar i vatten eller
vattenhaltiga lösningar.
•Vävnads snittet färgas av färgämnets joner
som har färgande egenskaper och som i de flesta fall attraheras av vävnadskomponenter med motsatt laddning.
• Färgreaktionen sker med hänsyn till
saltets färgande egenskaper.
Vad beror vävnadernas affinitet till vävnaden på?
•Reaktiva grupper hos färgmolekyl och vävnad •Diffusionshastigheten hos färgmolekylen – molekyl/aggregat-storlek – lösningsmedel – koncentration – pH – temperatur •Permeabilitet hos vävnad – täthet – ev. förbehandling – tid
Vad finns det för bindningar mellan atomer inom molekylen ?
•Jonbindning (vanligast, stark bindning) –Katjoner+(basiska färger): -NH3 + –Anjoner -(sura färger): -SO3- -COO- -O- •Kovalent bindning (stark bindning) • Komplexbindning • Hydrofoba/hydrofila krafter
Vad finns det för intermolekylära krafter?
–Van der Waals krafter (är svaga tillfälliga dipol-dipol-bindningar)
– Dispersionskrafter (elektrostatiska attraktiva krafter)
–Dipol-dipol bindning (dipol är en molekyl där den ena änden är mera negativt laddad än den andra änden)
– Vätebindning (mellan vattenmolekylerna bildas det vätebindningar)
Vad finns det för reaktiva grupper i vävnaden ?
- Nukleinsyror (DNA, RNA): =PO4-
- Sura heteropolysackarider och proteiner: -COO-
- Proteiner: -O-, -S-, -NH3+
- Sura heteropolysackarider: -SO4-
Hur delas färgämnen in efter sättet att binda till vävnaden ?
• Katjonfärgämnen (är basiskt färgämne): har + laddning (gillar sura vävnadskomponenter)
•Anjonfärgämnen (är surt färgämne): har – laddning (gillar basiska vävnadskomponenter)
• Amfortera färgämnen: har både + och – laddning (är neutrala färger, ex. indikatorfärgämnen)
• Indifferenta färgämnen: har varken + eller – laddning (färgegenskap beror på lösligheten och de löser sig direkt i cell
- eller vävnadsdelarna)
Förklara vad katjoner färger + (basiskafärger) är?
• Ex. metylgrönt,metylenblått, toluidinblått,
basisk fuchsin
• Färgar då sura vävnadskomponenter som; proteiner med karboxylgrupper, cellkärnor,bakterier, brosk, slem, nerver
Förklara vad anjonfärger - (sura färger) är..
• Ex. Eosin, pikrinsyra, syrafuchsin, anilinblå
• Färgar då basiska vävnadskomponenter som;
• Proteiner med fria aminogrupper, cytoplasma, muskel, kollagen, bindväv,
erytrocyter
Förklara vad neutrala, amfotera färger (jämvikt +/-) är…
• Mest känd är en kombination av
metylenblått eller azur och eosin.
• Färgar då: blodkroppar och
parasiter i blodet
Vad innebär indifferenta färger?
• Har inga saltbildande sura eller basiska
grupper. De löser sig direkt i cell
- eller vävnadsbestånsdelarna.
• Ex. Sudan III,IV, Sudan svart B,
Oljerött som Oil red O
• Färgar då: Fettsubstanser (neutralfett)
Hur fungerar Färgningsmetodik - indelning A (hur färgämnet fäster till vävnaden)?
• Direkta/substantiva metoder: – färglösningen behöver ej några tillsatser • Reducerande eller oxiderande metoder: – medel behövs innan färglösning. • Indirekta/adjektiva metoder: – ett betmedel som förmedlande länk fodras mellan färgmolekyl och vävnad • innan färglösningen • blandat med färglösningen (= färglack)
När används betmedel och vad är det för något ?
• Om färgämnet har dålig affinitet till vävnaden användes ibland betmedel, t ex: – Fosformolybden – Fosforwolframsyra – Järnklorid – Kalialun = kalium + aluminiumsulfat – Ammoniumalun = ammonium + aluminiumsulfat – Järnalun = ferri+ ammoniumsulfat –Kromalun= krom + kaliumsulfat
vad är definitionen av betmedel?
Definition: en polyvalent metalljon vilken
bildar komplex med vissa färgämnen
Vilket är de vanligaste betmedlet?
•De vanligaste betmedlen: – Aluminium (tre valenselektroner) –Järn (tre valenselektroner) – Ex. Htx med aluminium eller järn • Andra betmedel: – Krom, Kalcium, Bly, Wolfram, Molybden, Beryllium
Hur färgas cellkärnor ?
färgas med Htx+ betmedel ( aluminium eller järn)
- kärnorna blir rödaktiga (löslig färg)
- blåning fodras, pH ändras och färgen blir mörkare och olöslig!
—> i någon basisk lösning eller i kranvatten (som är svagt basiskt)
Vad innehåller blåning ?
Ammoniakvatten
Litiumkarbonat
Kranvatten
Hur färgas cytoplasman ?
Den är basisk, färgas av sur Eosin surgörs extra (isättika, HAc) lättlösligt i vatten.
- kort tid i vatten och 70%-ig alkohol. Vid dehydrering för senare montering
Hur fungerar färgningsmetodik- indelning B (hur färgämnet får rätt styrka) ?
- Progressiv metod: färgningen avbryts då bästa optimala färgnyansen erhållits.
- Regressiv metod: en överfärgning. Överskottet av färg löses bort (differentierar) tills optimal färgnyans erhålls (selektiv differentiering)
—> (syror, alkohol, saltsur alkohol, metallsaltlösning, kranvatten)
Hur fungerad förgningsmetodik -indelning C (hur de olika färgerna anbringas till vävnaden)
- Succedanfärgning: flera fört lösningar efter varandra.
- Simultanfärgning: en färgblandning av två eller fler färgsubstanser i samma färglösning.
Vad används ofta som lösningsmedel?
Destillerat vatten och alkohol av olika koncentrationer.
Vilken är färgämnets koncentration?
oftast mellan 0.1-2-0%
Nämn några grejer som är bra att tänka på om man vill ha lång hållbarhet…
–stamlösning – arbetslösning –A och B-lösning förvaras skilda –filtrera tillbaka –ev. konserveringsmedel –mörk flaska, kylskåp
Vad ska man märka lösningarna med?
–Ämne, koncentration, till vilken färgmetod, namn, datum , ev farosymbol
Allmänt om färgsubstanser, vad vet man?
- De flesta är giftiga
- Vid inköp av substans, se Colour Index-nr (CI-nr)
- Färgtabeller finns (Biological Stain Comission)
- Bokstavskodning
Vad är ett färgämne ?
•Ett ämne som absorberar
elektromagnetisk strålning i det synliga
området av spektrat (400-750 nm) = är färgad (eller ger färg)
• Vid histokemi:
–aromatiskt eller heteroaromatiskt ämne
– löslig i vatten eller polära lösningsmedel
–förmåga att binda sig till andra ämnen
Hur fungerar färgämnes grupper?
- Oftast en aromatisk förening
- Färgbärande grupp = kromofor
- Färgbindande grupp = auxokrom
Hur fungerar kromoforer (färgbärare)?
•Grupper av atomer som får färgämnet att
absorbera ljus i det ultravioletta eller synliga området av spektrat.
•Flera kromofora grupper krävs för absorbtion i det synliga området
•Exempel på kromofora grupper
– -N=N-azo
– -N=O nitroso
– -NO2 nitro
Hur fungerar auxokromerer (färgbindare) ?
•Absorberar ej själv ljus • Binder till kromofort system • Ändrar ljusabsorbtionen mot längre våglängd • Exempel på auxokroma grupper • -OH hydroxyl -NH2 amino -SH mercapto
vad hjälper auxokomerer till med?
Med hjälp av auxokromer ökas
färgintensiteten hos ett färgämne
Hur fungerar färgämnes indelning ?
•Efter ursprung
– Naturliga, syntetiska
• Efter sättet att binda sig till vävnaden
– Katjon + (basiska), anjon- (sura), amfortera(neutrala), indifferenta färgämnen
•Efter kemisk struktur
– aromatiska, heteroaromatiska, ej aromatiska f-ämnen
•Efter användningsområde
–vital, bindvävs, fett, kollagen, brosk, blod, bakterie, svamp färger
•Efter de kromofora
grupperna
–Azo, nitroso, nitro, etylen, carbonyl
Vilka metaller och metallsalter används vid visualisering ?
•De vanligast använda metalljonerna:
–Al3+, Fe3+, Fe2+, Cr3+
• Andra användbara metalljoner:
–silver, guld, bly, uranyl
Med hjälp av metalljoner kan man påvisa
om det finns reduktorer och oxidatorer i
vä vn a d e n
Metaller förkommande i vävnader ?
•Naturlig förekomst:
–Ca Mg Fe Zn Na K
•Patologisk förekomst:
–Pb Hg Ag Th Cd Au Cu
Vad är In situ hybridisering (
ISH, FISH)?
• En metod som utnyttjar både immunologiska och molekylärbiologiska tekniker för färgning. • In situ = på platsen • Hybridisering: enkelsträngad DNA-probe binder till framställt enkelsträngat DNA i vävnaden.
Vad har In situ hybridisering för användningsområde ?
• Användningsområde: – Sökande efter genetiska förändringar –Kromosom-mapping –Infektiösa sjukdomar Metoden är mycket specifik
Hur fungerar proberna?
•DNA-prober •RNA-prober •Proberna hybridiserar med specifikt komplementära DNA eller RNA-sekvenser i vävnaden. •Vanlig inmärkning av prober: –isotoper, biotin, fluorescerande ämnen
vad finns det för kontroller vid
infärgningars tillförlitlighet?
• Negativ
kontroll glas
• Positiv kontroll glas
patologins
roll i den diagnostiska processen …
Syftet med det histopatologiska utlåtandet är att ge behandlande läkare den information som behövs för optimal handläggning och prognosbedömning. För bättre diagnostisk säkerhet vid bedömning av oklara och svårvärderade fall rekommenderas användning av gällande: kriterier, immunhistokemiska färgningar, nedsnittning, konsultationer.
