Immunologisk metodik

Question 1

Vad är användnigns områden inom immunohistokemi (IHC)?

Answer 1

• Diagnos av immunologiska sjukdomar
• Diagnos-klassificera tumörer
• Påvisa mikroorganismer

Question 2

Hur färgas cellkärnor och cytoplasma inom immunohistokemi?

Answer 2

Blått= cellkärnor 
grön= Cytoplasmatiska

Question 3

Hur fungerar antikropparna inom detta ämne?

Answer 3

Fungerar som analytiska “verktyg”

Question 4

Vad är antigen för något ?

Answer 4

Ett främmande ämne.

Question 5

Vid ett antigen kan de fastna som Y liknande molekyler vilka är dessa?

Answer 5

Antikroppar = Y

Question 6

Varför är antikroppar bra vid analys?

Answer 6

Olika analysmetoder kan utnyttja olika antikroppars specifika förmåga att fästa till olika epitoper (antigena determinanter) på ett antigen. Samma cell kan märkas in med olika anitkroppar.

Question 7

Vad finns det för olika metoder ?

Answer 7

• Immunhistokemi= vävnad
• Immunocytokemi= celler
• Immunoprecipitation = lösa celler
• Dot blot, Slot blot= RNA/DNA seperation

Question 8

Vad är ett antigen mer specifikt? Ge exempel på antigen:

Answer 8

En för organismen främmande molekyl som framkallar en reaktion hos immunförsvaret. Denna reaktion leder till nybildning av antikroppar.

• Protein -proteinföreningar
• (Lipider)
• (Kolhydrater)
• Haptener, ex metall+protein

Question 9

Vad är en epitop ( antigen determinat)

Answer 9

Den del av ett antigen dit en specifik antikropp binder med en kort aminosyrasekvens.

Question 10

Vad består en antikropp utav?

Answer 10

Ett glykoprotein (makromolekyl bestående av protein och kolhydrater) som produceras i en organism vid antigenstimulering.

Har stort specificitet till det stimulerande antigenet! Mycket specifikt.

Question 11

Vilka klasser består en antikropp av?

Answer 11

Fem olika klasser: IgA, IgD, IgE,IgG och IgM

Question 12

Förklara hur antikropps kedjor och ”Fab” innebär ?

Answer 12

Kedjorna är sammanlänkade med disulfidbindningar.

Den yttre delen på båda kedjorna (Fab-domänen) är hypervariabla och bildar tillsammans ”antigen-bindning site”

Ex: IgG består av 4 kedjor, 2 tunga (blå) och 2 lätta (röda)

Question 13

Vad är den viktiga skillnaden mellan polyklonala och Monkklonala antikroppar?

Answer 13

PK= heterogen samling (flera olika antikroppar) riktade mot flera olika epitoper.
Kan affinitetsrenas.
- dessa märker in till flera olika epitoper.

MK= identiska antikroppar riktade mot en epitop.
”Mest önskvärt”- vid biokemisk tekniker
- binder till endast en epitop

Question 14

Varifrån kommer antikropparna ?

Answer 14

Dem köps in. Viktigt att kunna vilken man ska ha till vad osv.

Question 15

Vart bildas antikroppar ?

Answer 15

Dem bildas i B-lymfocyter (vita blodkroppar)

Question 16

Hur går det till när B-celler bildar antikroppar ?

Answer 16

• B-celler har membranbundna antikroppar bundna till sin yta.
• Främmande antigen träffar antikropp på B-cell.
• B-cellen stimuleras till delning ( genom utmognad till plasmacell) till samt tillverkning och utsöndring av flera antikroppar

Question 17

Varför är det svårare av produktion av monoklonala antikroppar?

Answer 17

Svårare för att man får tillsätta en sorts cancercell–> Antikropparna selektiviteras ut får då antikroppar. (?)

Question 18

Vart härstammar polyklonala antikroppar från?

Answer 18

Härstammar från flera olika cell-linjer och kan därmed binda till flera olika epitoper

Question 19

Vart härstammar monoklonala antikroppar från?

Answer 19

Från en enda cell-linje (klon) kan binda till endast en typ av epitop

Question 20

Vad innebär antigen-antikroppsreaktion?

Answer 20

Antikroppens “bindning site” känner igen en epitop på antigenet och binder sig dit med hjälp av:

• van der Waals krafter
• vätebindningar
• elektrostatiska interaktioner
• hydrofobiska krafter

Question 21

Vad innebär affinitet-aviditet?

Answer 21

Affinitet= styrkan i reaktionen mellan en antigen epitop och en anitkropp eller hur väl antigenets epitoper passar in i antikropppen

Aviditet= Sammanlagda styrkan mellan en antikropps bindningsställen och ett antigen

(“LOW”- epitopen ser annorlunda ut. Styrkan beror hur väl den passar in.)

Question 22

Vad är det vi vill ha vid färgning av antikroppar (affinitet)?

Answer 22

Vi vill vid färgning av antikroppar få “HÖG” affinitet.

Question 23

Vad innebär en korsreaktion?

Answer 23

Antikroppar binder till epitoper, som ej passar perfekt.

Question 24

Vad är aviditeten beroende utav?

Answer 24

Aviditeten är beroende av den sammanlagda affiniteten mellan ak “bindning site” och epitop.

Question 25

Vad innebär specifik/ ospecifik inbindning?

Answer 25

specifik: Bindning mellan Ak-Ag, till avsedd epitop. (man vill ha denna bindningen)

Ospecifik: Bindning beror ej på Ak-Ag reaktion exempel,

• endogent peroxidas/fosfat
• Endogent biotin
• Autofluorescens

Question 26

Vad innebär endogent?

Answer 26

Finns normalt i kroppen

Question 27

Vad innebär endogent peroxidas?

Answer 27

Inhiberas med väteperoxidlösning (H2O2)

Myeloida celler, hämoproteiner, myoglobin= blockerar i vävnaden

Question 28

Vad innebär endogent biotin?

Answer 28

Inhiberas med avidin och biotinlösning.

mitokondrier, lever, binjure, spottkörtel, karcinomer (bröst, colon)

Question 29

Vad finns det för markörer på antikroppar och hur fungerar det?

Answer 29

Ex. 
-enzymer (peroxidas, alk. fosfat) 
- Fluorohromer (rodamin) 
- Metaller (guld eller järn)
- Isotoper 
Man vill framkalla en "stjärna" vill se vart antikroppen har framkallat.

Question 30

Vad är ELISA för metod ?

Answer 30

Princip: antigen binds till brunnarnas väggar. prov tillsätts. Provets antikroppar reagerar med brunnarnas antigen.

• Celler i lösning, Desto mer som finns i brunnarna desto starkare färg.

Question 31

Vad är FACS (fluorescene activated cellsorting) för metod?

Answer 31

• Celler i lösning märks med fluorescerande antikroppar och får en laddning.
• Cellerna passerar en laser- separation/sortering utifrån storlek och grumlighet.
• Fluorescensen mäts. Mängden ljus motsvarar mängden celler av en viss typ (olika celler sänder ut olika fluorescens)
• Celler passerar laddade plattor och sorteras utifrån laddning.

Question 32

Hur går det till för att få fram en IHC färgning?

Answer 32

• vävnad (snitt) eller celler.
• Deparaffinering
• Rehydrering
• Ak. i ett eller flera steg
• framkallning av färg
• Dehydrering
• Montering av täckglas
• Mikroskopering

Question 33

Vad söker antikroppar efter ?

Answer 33

Olika antikroppar söker sig till olika epitoper i vävnaden

Question 34

Vad innebär direkt och indirekt metoder?

Answer 34

En direkt metod = ELISA med endast en primär antikropp.
En indirekt metod med två steg= Primär antikropp i form av kanin eller liknande. + e sekundär antikropp.
En indirekt metod med tre steg= Primär+ sekundär + ett enzym också.

–> viktigt att tänka på är att ju fler steg man sätter på ju fler felaktiga svar = ospecifikare inbindning

Question 35

Vad innebär ett falskt positivt analyssvar?

Answer 35

Antikroppen binder till fler eller flera olika epitoper.
Förekomst av Ak-bindning endogen komponent.
Exempel på vad som kan gått fel:
- Preparering har förstört epitoperna
- glömt anitkropparna
- paraffin kvar på snittet
- gamla lösningar

Question 36

Vad är det för kontroller vid analysen ?

Answer 36

Negativ kontroll:

• Utelämna primäraantikroppen
• elämna alla antikroppar

Positiv kontroll:
- positiv testvävnad. skall helst graderas, där endast en viss styrka inmärkningen skall godkännas