Immunologisk metodik Flashcards
Vad är användnigns områden inom immunohistokemi (IHC)?
- Diagnos av immunologiska sjukdomar
- Diagnos-klassificera tumörer
- Påvisa mikroorganismer
Hur färgas cellkärnor och cytoplasma inom immunohistokemi?
Blått= cellkärnor grön= Cytoplasmatiska
Hur fungerar antikropparna inom detta ämne?
Fungerar som analytiska “verktyg”
Vad är antigen för något ?
Ett främmande ämne.
Vid ett antigen kan de fastna som Y liknande molekyler vilka är dessa?
Antikroppar = Y
Varför är antikroppar bra vid analys?
Olika analysmetoder kan utnyttja olika antikroppars specifika förmåga att fästa till olika epitoper (antigena determinanter) på ett antigen. Samma cell kan märkas in med olika anitkroppar.
Vad finns det för olika metoder ?
- Immunhistokemi= vävnad
- Immunocytokemi= celler
- Immunoprecipitation = lösa celler
- Dot blot, Slot blot= RNA/DNA seperation
Vad är ett antigen mer specifikt? Ge exempel på antigen:
En för organismen främmande molekyl som framkallar en reaktion hos immunförsvaret. Denna reaktion leder till nybildning av antikroppar.
- Protein -proteinföreningar
- (Lipider)
- (Kolhydrater)
- Haptener, ex metall+protein
Vad är en epitop ( antigen determinat)
Den del av ett antigen dit en specifik antikropp binder med en kort aminosyrasekvens.
Vad består en antikropp utav?
Ett glykoprotein (makromolekyl bestående av protein och kolhydrater) som produceras i en organism vid antigenstimulering.
Har stort specificitet till det stimulerande antigenet! Mycket specifikt.
Vilka klasser består en antikropp av?
Fem olika klasser: IgA, IgD, IgE,IgG och IgM
Förklara hur antikropps kedjor och ”Fab” innebär ?
Kedjorna är sammanlänkade med disulfidbindningar.
Den yttre delen på båda kedjorna (Fab-domänen) är hypervariabla och bildar tillsammans ”antigen-bindning site”
Ex: IgG består av 4 kedjor, 2 tunga (blå) och 2 lätta (röda)
Vad är den viktiga skillnaden mellan polyklonala och Monkklonala antikroppar?
PK= heterogen samling (flera olika antikroppar) riktade mot flera olika epitoper.
Kan affinitetsrenas.
- dessa märker in till flera olika epitoper.
MK= identiska antikroppar riktade mot en epitop.
”Mest önskvärt”- vid biokemisk tekniker
- binder till endast en epitop
Varifrån kommer antikropparna ?
Dem köps in. Viktigt att kunna vilken man ska ha till vad osv.
Vart bildas antikroppar ?
Dem bildas i B-lymfocyter (vita blodkroppar)
Hur går det till när B-celler bildar antikroppar ?
- B-celler har membranbundna antikroppar bundna till sin yta.
- Främmande antigen träffar antikropp på B-cell.
- B-cellen stimuleras till delning ( genom utmognad till plasmacell) till samt tillverkning och utsöndring av flera antikroppar
Varför är det svårare av produktion av monoklonala antikroppar?
Svårare för att man får tillsätta en sorts cancercell–> Antikropparna selektiviteras ut får då antikroppar. (?)
Vart härstammar polyklonala antikroppar från?
Härstammar från flera olika cell-linjer och kan därmed binda till flera olika epitoper
Vart härstammar monoklonala antikroppar från?
Från en enda cell-linje (klon) kan binda till endast en typ av epitop
Vad innebär antigen-antikroppsreaktion?
Antikroppens “bindning site” känner igen en epitop på antigenet och binder sig dit med hjälp av:
- van der Waals krafter
- vätebindningar
- elektrostatiska interaktioner
- hydrofobiska krafter
Vad innebär affinitet-aviditet?
Affinitet= styrkan i reaktionen mellan en antigen epitop och en anitkropp eller hur väl antigenets epitoper passar in i antikropppen
Aviditet= Sammanlagda styrkan mellan en antikropps bindningsställen och ett antigen
(“LOW”- epitopen ser annorlunda ut. Styrkan beror hur väl den passar in.)
Vad är det vi vill ha vid färgning av antikroppar (affinitet)?
Vi vill vid färgning av antikroppar få “HÖG” affinitet.
Vad innebär en korsreaktion?
Antikroppar binder till epitoper, som ej passar perfekt.
Vad är aviditeten beroende utav?
Aviditeten är beroende av den sammanlagda affiniteten mellan ak “bindning site” och epitop.
Vad innebär specifik/ ospecifik inbindning?
specifik: Bindning mellan Ak-Ag, till avsedd epitop. (man vill ha denna bindningen)
Ospecifik: Bindning beror ej på Ak-Ag reaktion exempel,
- endogent peroxidas/fosfat
- Endogent biotin
- Autofluorescens
Vad innebär endogent?
Finns normalt i kroppen
Vad innebär endogent peroxidas?
Inhiberas med väteperoxidlösning (H2O2)
Myeloida celler, hämoproteiner, myoglobin= blockerar i vävnaden
Vad innebär endogent biotin?
Inhiberas med avidin och biotinlösning.
mitokondrier, lever, binjure, spottkörtel, karcinomer (bröst, colon)
Vad finns det för markörer på antikroppar och hur fungerar det?
Ex. -enzymer (peroxidas, alk. fosfat) - Fluorohromer (rodamin) - Metaller (guld eller järn) - Isotoper Man vill framkalla en "stjärna" vill se vart antikroppen har framkallat.
Vad är ELISA för metod ?
Princip: antigen binds till brunnarnas väggar. prov tillsätts. Provets antikroppar reagerar med brunnarnas antigen.
- Celler i lösning, Desto mer som finns i brunnarna desto starkare färg.
Vad är FACS (fluorescene activated cellsorting) för metod?
- Celler i lösning märks med fluorescerande antikroppar och får en laddning.
- Cellerna passerar en laser- separation/sortering utifrån storlek och grumlighet.
- Fluorescensen mäts. Mängden ljus motsvarar mängden celler av en viss typ (olika celler sänder ut olika fluorescens)
- Celler passerar laddade plattor och sorteras utifrån laddning.
Hur går det till för att få fram en IHC färgning?
- vävnad (snitt) eller celler.
- Deparaffinering
- Rehydrering
- Ak. i ett eller flera steg
- framkallning av färg
- Dehydrering
- Montering av täckglas
- Mikroskopering
Vad söker antikroppar efter ?
Olika antikroppar söker sig till olika epitoper i vävnaden
Vad innebär direkt och indirekt metoder?
En direkt metod = ELISA med endast en primär antikropp.
En indirekt metod med två steg= Primär antikropp i form av kanin eller liknande. + e sekundär antikropp.
En indirekt metod med tre steg= Primär+ sekundär + ett enzym också.
–> viktigt att tänka på är att ju fler steg man sätter på ju fler felaktiga svar = ospecifikare inbindning
Vad innebär ett falskt positivt analyssvar?
Antikroppen binder till fler eller flera olika epitoper.
Förekomst av Ak-bindning endogen komponent.
Exempel på vad som kan gått fel:
- Preparering har förstört epitoperna
- glömt anitkropparna
- paraffin kvar på snittet
- gamla lösningar
Vad är det för kontroller vid analysen ?
Negativ kontroll:
- Utelämna primäraantikroppen
- elämna alla antikroppar
Positiv kontroll:
- positiv testvävnad. skall helst graderas, där endast en viss styrka inmärkningen skall godkännas
