PRÀCTIQUES Flashcards
Citocalasina
Impedeix la polimerització dels filaments d’actina, ja que s’uneix a l’extrem +. Comporta la pérdua de l’estructura i l’arrodoniment de la cèl·lula.
Colquicina
Inhibeix la polimerització dels microtúbuls, ja que s’uneix a les subunitats lliures.
NRK
Línia cel·lular estable. Són cèl·lules epitelials renals immortalitzades que es divideixen indefinidament. Forma tipus fibroblast. S’adhereix al substrat.
HeLa
Cèl·lules tumorals immortals. Forma tipus fibroblast. S’adhereix al substrat.
Línia cel·lular primària
Línia que obtenim quan fem una disseció del ronyó i n’agafem unes quantes cèl·lules. Es divideixen poques vegades (3-4).
Confluència
% de superfície en un cultiu ocupat per les cèl·lules. Quan l’assolim ja no es divideix més. Determina el fenomen de la inhibició pel contacte.
Es descongelen les cèl·lules i adopten una forma rodona (es desenganxen). Ho posem en vertical i desprès en horitzontal per obtenir una monocapa confluent.
Fenomen de la inhiboció pel contacte
Quan una cèl·lula està unida a altres ja no es divideix. És pels FC que indueixen una senyal mitogènica. FC+receptors. No s’indueix una senyal mitogènica suficient i el contacte inhibeix el creixement per la disminució de receptors.
Amb què es van fixar les cèl·lules?
Paraformaldehid 4%.
Quina quantitat de colquicina o citocalasina portaven les cèl·lules NRK?
10 µM.
PBS
Phosphate buffer saline. S’utilitza per netejar.
- NaCl.
- Tampó fosfat monobàsic.
- Tampó fosfat dibàsic.
- KCl.
Solució de permeabilització
- PBS.
- Tritó X-100.
Solució de bloqueig
- PBS.
- Glicina.
- Abúmina de sèrum boví.
Fal·loïdina-TRITC
Isotiocianat de tetrametil-rodamina.
Anticós secundari FITC
Isotiocianat de fluorescència. FITC és un fluorocrom.
Solució per a tinció nuclear
Bis-benzimida (Hoescht 33342).
Medi de muntatge per a fluorescència
Fluoromount.
Experiment control
Esperem no veure res, ja que l’anticós secundari no s’unirà al primari.
WST
White soluble tetrazolium salts.
És una tècnica utilitzada per mesura la viabilitat cel·lular. Mesura l’activitat metabòlica mitocondrial mesurant l’activitat de les deshidrogenases mitocondrial
Les deshidrogenases oxiden el NADH reduit, que redueix EC a EC-H i m’oxida les sals de tetrazolium a formazan. Això m’enterbolitzarà el cultiu. Co més túrbul, més cèl·lules viables.
Si no funcionen les DH no es forma formazan i tindrà una DO baixa.
Com ha de ser el control - en la tècnica WST?
DO molt alta.
A quina absorbància es mira la formació de formazan?
450 nm.
DMSO
Dimetilsulfòxid. És un agent crioprotector que permet congelar les cèl·lules. 5-10%.
Tècnica del blau tripan
S’utilitza per determinar la viabilitat cel·lular. És un colorant vital que permet distingir les cèl·lules vives de les mortes. Les vives, amb membranes intactes i funcionals, no poden absorbir-lo. Les mortes queden tenyides de blau.
Cambra de Neubauer
S’utilitza pel comptatge de les cèl·lules vives. és un portaobjectes graduat: 1mm x 1mm x 0,1mm = 100 nL
Per què es posen antibiòtics en els cultius cel·lulars?
Per prevenir la infecció bacteriana.
Estreptomicina
Inhibeix la traducció dels bacteris.
Càlcul viabilitat
%viabilitat = 100 x (nre. cèl·lules totals - nre. cèl·lules mortes)/nre. cèl·lules totals
Incubador
- 37º: si és major caca i si és inferior no s’adhereixen.
- Humitat det: no s’evaporarà el mitjà de cultiu.
- Estufa de CO2: el mitjà de cultiu té tendència a l’alcalinitat i llavors la cèl·lula morirà perquè no hi ha degradació. Això s’ha de corretgir amb CO2, ja que a les cèl·lules és de 7,4.
Quins són els avantatges i els desavantatges del procés de fixació de les cèl·lules en les tècniques d’immunocitoquímica?
Conservar la forma i fer una permebilització que ens permeti l’entrada dels reactius i els anticossos.
La permeabilització és sempre necessària?
No, si són hidrofobes o tenen mecanismes per integrar-lo.
Per què es duu a terme el bloqueig prèviament a la incubació amb els anticossos? En què consisteix?
Està formada per la GLICINA, el tampó PBS i BSA (albúmina serico-bovina). Bloquejem perquè alhora de posar-lo el farà aldehid (angle del grup funcional molt semblant a la Ig), té n angle similar al dels anticossos. Té la finalitat de bloquejar le sunions de baixa afinitat dels anticossos als diferents antígens.
Les etapes seguides en la tècnica d’immunocitoquímica han estat: muntatge, bloqueig, fixació, permeabilització, incubació amb l’anticòs secundari, incubació amb l’anticòs primari o les molècules afins, tinció del nucli i observació. Quina és la seqüència lògica de cadascuna de les etapes en aquesta tècnica?
- Fixació.
- Permeabilització.
- Bloqueig.
- Incubació anticòs primari.
- Incubació anticòs secundari.
- Tinció nucli.
- Muntatge.
- Observació.
37º?
Són les condicions fisiològiques. Augmenta l’afinitat antígen-anticòs.
Quina característica ha de tenir un medi de muntatge per a la microscòpia d’epifluorescència com ara el Fluoromount?
Ha de iluminar-se amb la llum d’excitació i no presentar una llum de fluoresència.
Quin és l’objectiu d’introduir cobreobjectes de control en les tècniques d’immunocitoquímica?
Comprovar que la tèncica funciona correctament.
Fluorescència rodamina (TRITC)
Vermella. Actina.
Fluorescència FITC
Verd. Tubulina.
Monoclonal
Sempre es produeix en ratolí.
Fluorescència cianina
Blava.
Quin microscopi hem utilitzat?
Microscopi invertit de contrast de fases.
Microscopi de fluorescència
Utilitza una llum molt energètica. Quan incideixen en fluorocroms un electró s’excita i torna al seu lloc.
- Rodamina: és molt energètica. Li posem Verd i dóna VERMELL.
- FITC: necessita més E. Li posem una llum d’excitació Blava i dóna VERD.
- Cromatina: posem llum d’exitació UV (molt energètica) i dóna BLAU.
Quin error s’ha pogut cometre si en fer un comptatge amb la cambra de Neubauer trobem molt poques cèl·lules?
S’ha pogut produir un error en la RESUSPENSIÓ i haver llençat part de les cèl·lules del pellet.
Quins són els principals paràmetres que s’hauran de controlar en una incubadora per a cultius de cèl·lules (cèl·lules de mamífers) perquè es donin les condicions òptimes per al creixement cel·lular?
T= 37º. Humitat= 90% CO2= 5%.
Quina funció i limitació presenta el dimetilsulfòxid (DMSO)?
És un agent crioprotector que permet mantenir les cèl·lules congelades. Té la limitació que és molt TÒXIC i s’ha de dur a terme una descongelació RÀPIDA.
Per a què s’utilitza la tinció del blau tripan? Com actua el blau tripan sobre les cèl·lules?
S’utilitza per detectar les cèl·lules mortes. Travessa la membrana d’aquestes i les tenyeix de blau.
Un cop obtinguts els estocs cel·lulars, quina és la seqüència de passos que es recomana per congelar-los i mantenir-los? Per què?
- Centrifugació.
- Resuspendre.
- -20ºC 1 nit.
- -80ºC 3 dies.
- Nitrogen líquid (-196ºC).
Quin és el fonament de la tècnica de citotoxicitat cel·lular mitjançant la utilització del reactiu WST-1 (sals de tetrazole)?
Es basa en estudiar l’activitat metabòlica MITOCONDRIAL. Es basen en el pas de WST-1 a formazan.
Per què s’observa el canvi de color del medi de cultiu en l’assaig de citotoxicitat cel·lular amb sals de tetrazole?
Perquè s’han produit sals de formazan.
Quina és la finalitat de la utilització de solucions d’SDS i de NaCl en l’assaig de citotoxicitat? Es podrien substituir per altres molècules? Raoneu la resposta.
La finalitat és tenir un control + i un -.
Immunocitoquímica
Utilitzen la propietat dels anticossos de reconèixer antígens de forma específica i amb alta afinitat i permeten estudiar la distribució subcel·lular de pràcticament qualsevol proteïna.
Anticòs primari
Anticòs que reconeix un antígen. Han d’estar units covalentment a un CROMÒFOR (molècula visible), a un FLUOROCROM (fluorescent) o a un enzim com la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rave picant sobre el qual es pugui fer una reacció colorimètrica.
Anticòs secundari
Anticòs que reconeix un altre anticòs.
Immunodetecció directa
Amb anticòs primari i secundari i el primari unit covalentment a alguna cosa que el faci visible.
La immunodetecció directa no és gaire utilitzada, sobretot a causa del fet que requereix la utilització d’anticossos units de forma covalent a la molècula escollida. Aquesta unió s’ha de fer prèviament a l’experiment d’immunolocalització, i implica una reacció d’entrecreuament (cross-linking).
Immunodetecció indirecta
Utiltzació d’anticossos secundaris units covalentment a un fluorocrom o enzim. Els anticossos secundaris són anticossos dirigits contra les cadenes constants de les IgG d’una determinada espècie (per exemple anticossos anti-IgG de conill). S’obtenen en una segona espècie (per exemple anticossos anti- IgG de conill obtingut en cabra).
Avantatges Immunodetecció indirecta
- Només necessitem uns quants anticossos secundaris (dirigits contra les principals espècies d’obtenció d’anticossos primaris, majoritàriament conill i ratolí), que ja són subministrats units covalentment al fluorocrom o enzim desitjats.
- Augmenta la sensibilitat del resultat final, atès que cada anticòs primari és reconegut per diferents anticossos secundaris, amplificant molt el senyal i reduint el soroll de fons (background).
