Polymerase Chain Reaction Flashcards
Función de PCR
Obtener un gran número de copias de fragmentos de ADN basado en la replicación
¿Qué se usa para reemplazar la DNA polimerasa?
Taq polimerasa (thermopilus acuaticus): bacterias en geisssers ya que soporta 95° para la PCR
Función de Taq
Polmeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente
¿Qué se quiere para hacer una PCR?
- Secuencia de DNA
- Enzima DNA polimerasa
- Desorribunucleótidos (dNTP)
- Primers
Cofactores como MgCl2
dNTP
Desoxiribonucléotidos
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Adenina, citocina, guanina y timina
Amortiguador
Es un buffer para regular el PH a 8.4 y funcione Taq polimerasa (neutraliza)
Cofactor cloruro de magnesio
Cofactor de Taq la ayuda en su reacción
¿De dónde provienen los primers?
Los diseñan los investigadores de acuerdo a lo qué se busca.
Específicos: insulina, polimorifsmos, bacteria
¿Para qué se usan los primers?
Reconocer secuencias blancos y reconocen extremos 3’
Tipos de primers
Forward 5 a 3 ‘
Reverse 3 a 5’
¿Qué secuencias fortalecen los primers?
GC- guanina citosina
+ difícil que se separen
Fases de la PCR
- Desnaturalización: se separan cadenas de DNA a 95° durante 35 s
- Hibridación: los primers se alinean al extremo 3’ de 50 a 60°
- Extensión: Taq polimerasa actua sobre el complejo templado de primers.
- Agrega dNTPS complementarios para crear cadenas completas a los 72°
¿Cómo se calcula la temperatura de alineamiento?
(4G+C)+(2A+T)
Ác. nucleicos
Por cada ciclo se genera el _____ de hebras
Doble
Al final de la PCR se realiza ______
Un gel de electroforesis
Electroforesis
Técncia mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo electríco
Elementos para electroforesis
- Camara de electroforesis
- Gel de agarosa
- Marcador de peso molecular
- Transiluminador
Función de cámara de electroforesis
Genera campo eléctrico alrededor de un gel con dos polos que se conectan a una fuente de energía
Gel de agarosa
Polisacárido extraído de algas marinas, separa fragmentos de ADNde 100 pb a 25 kb
pb= pares de base
¿De qué depende el tamaño de los poros de la matriz de gel?
De la concentración de agorosa es inversamente proporcional al tamaño del poro
¿Cómo se escoge la concentración de agorosa?
De acuerdo al tamaño del ácido nucleico que se va a analizar
Marcador de peso molecular
Mezcla de moléculas de DNA o proteínas de tamaño conocido que permiten comparar el tamaño de las moléculas (ác nucleicos o proteínas) en las muestras sometidas a electrofóresis
Característica y aplicación de PCR estándar
- Amplifica el segmento de ADN con partidores y su detección es mediante geles de agarosa
- Detección cualitativa de un segmento de ADN (si está o no)
Característica y aplicación de PCR múltiple
- Amplifación de 2 o más segmentos de ADN utilizando varios partidores en un sola reacción de amplificación.
- Detección mediante geles de agarosa
- Detecta cualitativamente varios segmentos de ADN
Ejemplo: hallar varias bacterias en una muestra de un paciente
