Polymerase Chain Reaction Flashcards
Función de PCR
Obtener un gran número de copias de fragmentos de ADN basado en la replicación
¿Qué se usa para reemplazar la DNA polimerasa?
Taq polimerasa (thermopilus acuaticus): bacterias en geisssers ya que soporta 95° para la PCR
Función de Taq
Polmeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente
¿Qué se quiere para hacer una PCR?
- Secuencia de DNA
- Enzima DNA polimerasa
- Desorribunucleótidos (dNTP)
- Primers
Cofactores como MgCl2
dNTP
Desoxiribonucléotidos
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Adenina, citocina, guanina y timina
Amortiguador
Es un buffer para regular el PH a 8.4 y funcione Taq polimerasa (neutraliza)
Cofactor cloruro de magnesio
Cofactor de Taq la ayuda en su reacción
¿De dónde provienen los primers?
Los diseñan los investigadores de acuerdo a lo qué se busca.
Específicos: insulina, polimorifsmos, bacteria
¿Para qué se usan los primers?
Reconocer secuencias blancos y reconocen extremos 3’
Tipos de primers
Forward 5 a 3 ‘
Reverse 3 a 5’
¿Qué secuencias fortalecen los primers?
GC- guanina citosina
+ difícil que se separen
Fases de la PCR
- Desnaturalización: se separan cadenas de DNA a 95° durante 35 s
- Hibridación: los primers se alinean al extremo 3’ de 50 a 60°
- Extensión: Taq polimerasa actua sobre el complejo templado de primers.
- Agrega dNTPS complementarios para crear cadenas completas a los 72°
¿Cómo se calcula la temperatura de alineamiento?
(4G+C)+(2A+T)
Ác. nucleicos
Por cada ciclo se genera el _____ de hebras
Doble
Al final de la PCR se realiza ______
Un gel de electroforesis
Electroforesis
Técncia mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo electríco
Elementos para electroforesis
- Camara de electroforesis
- Gel de agarosa
- Marcador de peso molecular
- Transiluminador
Función de cámara de electroforesis
Genera campo eléctrico alrededor de un gel con dos polos que se conectan a una fuente de energía
Gel de agarosa
Polisacárido extraído de algas marinas, separa fragmentos de ADNde 100 pb a 25 kb
pb= pares de base
¿De qué depende el tamaño de los poros de la matriz de gel?
De la concentración de agorosa es inversamente proporcional al tamaño del poro
¿Cómo se escoge la concentración de agorosa?
De acuerdo al tamaño del ácido nucleico que se va a analizar
Marcador de peso molecular
Mezcla de moléculas de DNA o proteínas de tamaño conocido que permiten comparar el tamaño de las moléculas (ác nucleicos o proteínas) en las muestras sometidas a electrofóresis
Característica y aplicación de PCR estándar
- Amplifica el segmento de ADN con partidores y su detección es mediante geles de agarosa
- Detección cualitativa de un segmento de ADN (si está o no)
Característica y aplicación de PCR múltiple
- Amplifación de 2 o más segmentos de ADN utilizando varios partidores en un sola reacción de amplificación.
- Detección mediante geles de agarosa
- Detecta cualitativamente varios segmentos de ADN
Ejemplo: hallar varias bacterias en una muestra de un paciente
PCR-RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphisms)
PCR estándar pero con paso posterior con enzimas de restricción. Detecta poliformismos genéticos SNPs
PCR -RT
Reverse transcriptase
Síntesis de cADN a partir de ARN, mediante transcricion reversa y luego una PCR
Función PCR-RT
Expresar genes y detectar virus de ARN
La prueba PCR de covid es de tipo______
Combianción entre transcriptasa reversa y mutiple y tiempo real.
qPCR o PCR tiempo real
PCR estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluoroforos para detectar fragmentos amplificados.
Multiplex en una computadora se obtienen los datos de los 40 ciclos +-
Función de qPCR
- Detección cualitiva de uno o varios segmentos de ADN.
- Se cuantifica el ADN o ver expresión de genes (RT)
- Carga viral de virus y bacterias, insulina, miRNAS
En la qPCR los productos amplificados pueden detectarse en cada ciclo
Verdadero
¿Cuál es le metodo más sensible (específica) para detectar y cuantificar ác. nucleicos?
PCR tiempo real
Detecta pequeña carga viral de un virus
Elementos para reacción de qPCR
- Templado -DNA
- Enzima- Taq polimerasa
- Desoxirribonucleótidos trisfosfatados dNTPS
- Primers (oligonucleotidos)
- Magnesio
- Buffer
- Agua
- Sistema reportero fluorescencia
¿Cómo funciona el sistema reporte fluorescencia específico?
Se usan sondas fluorescentes de oligonucleótidos con un reportero fluorescente.
Las sondas se crean en el Lab. La sonda se alinea con los primers. Taq pone NT , rompe sonda (exonucleasa) pone NT y libera fluroforo que emite luz para saber dónde esta la secuencia deseada. Cuando termina gen brilla al finalizar elongación
¿Para qué funciona el fluroforo en tiempo real?
Marca de manera fluorescente oligonucleótidos que detectan específicamente la aparición del producto deseado como un gen
Sistema de flurorescencia no específico
Moléculas intercalantes que tiene afinidad por el dsDNA y generan una señal intercalante como syberGreen.
Función sistema de fluorescencia no específico
Identificar genes por afinidad al colorante. No detecta error en complementarse, une la molécula fluorescente solo si hay doble cadena
Cuantificación PCR absoluta
Conocer numero exacto de copias amplificadas del blanco .
Concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra
Medir la carga viral o bacteriana de un tejido
Cuantificación relativa en qPCR
- Evalua cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos
- Cambios se basan en los níveles del RNAm del gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia
Tengo 10 miRNAs pero debo tener 20. Ver exceso o déficit
Cada línea es un _____
¿Cuál tiene más carga viral?
Paciente
Al inicio el verde luego el rojo
