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Biología Molecular Pt. 2 > Polymerase Chain Reaction > Flashcards

Polymerase Chain Reaction Flashcards

1
Q

Función de PCR

A

Obtener un gran número de copias de fragmentos de ADN basado en la replicación

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2
Q

¿Qué se usa para reemplazar la DNA polimerasa?

A

Taq polimerasa (thermopilus acuaticus): bacterias en geisssers ya que soporta 95° para la PCR

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3
Q

Función de Taq

A

Polmeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente

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4
Q

¿Qué se quiere para hacer una PCR?

A
  • Secuencia de DNA
  • Enzima DNA polimerasa
  • Desorribunucleótidos (dNTP)
  • Primers

Cofactores como MgCl2

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5
Q

dNTP

A

Desoxiribonucléotidos
dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Adenina, citocina, guanina y timina

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6
Q

Amortiguador

A

Es un buffer para regular el PH a 8.4 y funcione Taq polimerasa (neutraliza)

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7
Q

Cofactor cloruro de magnesio

A

Cofactor de Taq la ayuda en su reacción

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8
Q

¿De dónde provienen los primers?

A

Los diseñan los investigadores de acuerdo a lo qué se busca.
Específicos: insulina, polimorifsmos, bacteria

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9
Q

¿Para qué se usan los primers?

A

Reconocer secuencias blancos y reconocen extremos 3’

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10
Q

Tipos de primers

A

Forward 5 a 3 ‘
Reverse 3 a 5’

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11
Q

¿Qué secuencias fortalecen los primers?

A

GC- guanina citosina
+ difícil que se separen

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12
Q

Fases de la PCR

A
  • Desnaturalización: se separan cadenas de DNA a 95° durante 35 s
  • Hibridación: los primers se alinean al extremo 3’ de 50 a 60°
  • Extensión: Taq polimerasa actua sobre el complejo templado de primers.
  • Agrega dNTPS complementarios para crear cadenas completas a los 72°
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13
Q

¿Cómo se calcula la temperatura de alineamiento?

A

(4G+C)+(2A+T)

Ác. nucleicos

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14
Q

Por cada ciclo se genera el _____ de hebras

A

Doble

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15
Q

Al final de la PCR se realiza ______

A

Un gel de electroforesis

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16
Q

Electroforesis

A

Técncia mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo electríco

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17
Q

Elementos para electroforesis

A
  • Camara de electroforesis
  • Gel de agarosa
  • Marcador de peso molecular
  • Transiluminador
18
Q

Función de cámara de electroforesis

A

Genera campo eléctrico alrededor de un gel con dos polos que se conectan a una fuente de energía

19
Q

Gel de agarosa

A

Polisacárido extraído de algas marinas, separa fragmentos de ADNde 100 pb a 25 kb

pb= pares de base

20
Q

¿De qué depende el tamaño de los poros de la matriz de gel?

A

De la concentración de agorosa es inversamente proporcional al tamaño del poro

21
Q

¿Cómo se escoge la concentración de agorosa?

A

De acuerdo al tamaño del ácido nucleico que se va a analizar

22
Q

Marcador de peso molecular

A

Mezcla de moléculas de DNA o proteínas de tamaño conocido que permiten comparar el tamaño de las moléculas (ác nucleicos o proteínas) en las muestras sometidas a electrofóresis

23
Q

Característica y aplicación de PCR estándar

A
  • Amplifica el segmento de ADN con partidores y su detección es mediante geles de agarosa
  • Detección cualitativa de un segmento de ADN (si está o no)
24
Q

Característica y aplicación de PCR múltiple

A
  • Amplifación de 2 o más segmentos de ADN utilizando varios partidores en un sola reacción de amplificación.
  • Detección mediante geles de agarosa
  • Detecta cualitativamente varios segmentos de ADN
    Ejemplo: hallar varias bacterias en una muestra de un paciente
25
Q

PCR-RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphisms)

A

PCR estándar pero con paso posterior con enzimas de restricción. Detecta poliformismos genéticos SNPs

26
Q

PCR -RT

A

Reverse transcriptase
Síntesis de cADN a partir de ARN, mediante transcricion reversa y luego una PCR

27
Q

Función PCR-RT

A

Expresar genes y detectar virus de ARN

28
Q

La prueba PCR de covid es de tipo______

A

Combianción entre transcriptasa reversa y mutiple y tiempo real.

29
Q

qPCR o PCR tiempo real

A

PCR estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluoroforos para detectar fragmentos amplificados.

Multiplex en una computadora se obtienen los datos de los 40 ciclos +-

30
Q

Función de qPCR

A
  • Detección cualitiva de uno o varios segmentos de ADN.
  • Se cuantifica el ADN o ver expresión de genes (RT)
  • Carga viral de virus y bacterias, insulina, miRNAS
31
Q

En la qPCR los productos amplificados pueden detectarse en cada ciclo

A

Verdadero

32
Q

¿Cuál es le metodo más sensible (específica) para detectar y cuantificar ác. nucleicos?

A

PCR tiempo real

Detecta pequeña carga viral de un virus

33
Q

Elementos para reacción de qPCR

A
  • Templado -DNA
  • Enzima- Taq polimerasa
  • Desoxirribonucleótidos trisfosfatados dNTPS
  • Primers (oligonucleotidos)
  • Magnesio
  • Buffer
  • Agua
  • Sistema reportero fluorescencia
34
Q

¿Cómo funciona el sistema reporte fluorescencia específico?

A

Se usan sondas fluorescentes de oligonucleótidos con un reportero fluorescente.
Las sondas se crean en el Lab. La sonda se alinea con los primers. Taq pone NT , rompe sonda (exonucleasa) pone NT y libera fluroforo que emite luz para saber dónde esta la secuencia deseada. Cuando termina gen brilla al finalizar elongación

35
Q

¿Para qué funciona el fluroforo en tiempo real?

A

Marca de manera fluorescente oligonucleótidos que detectan específicamente la aparición del producto deseado como un gen

36
Q

Sistema de flurorescencia no específico

A

Moléculas intercalantes que tiene afinidad por el dsDNA y generan una señal intercalante como syberGreen.

37
Q

Función sistema de fluorescencia no específico

A

Identificar genes por afinidad al colorante. No detecta error en complementarse, une la molécula fluorescente solo si hay doble cadena

38
Q

Cuantificación PCR absoluta

A

Conocer numero exacto de copias amplificadas del blanco .
Concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra
Medir la carga viral o bacteriana de un tejido

39
Q

Cuantificación relativa en qPCR

A
  • Evalua cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos
  • Cambios se basan en los níveles del RNAm del gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia

Tengo 10 miRNAs pero debo tener 20. Ver exceso o déficit

40
Q

Cada línea es un _____
¿Cuál tiene más carga viral?

A

Paciente
Al inicio el verde luego el rojo

Biología Molecular Pt. 2 (14 decks)

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