DNA recombinante Flashcards
Formas de reproducción parasexual en bacterias
Transformacion
Conjugación
Transducción
Reproducción por transformación
Bacteria capta del medio ADN libre que procede de otra bacteria o célula.
Reproducción por conjugación
Bacteria hace contacto físico con otra bacteria con sus pilis, por donde pasan plasmido replicado.
Transducción
Bacteriófago deposita su DNA en el DNA cromosómico de la bacteria.
La bacteria al replicarse copiará su ADN con parte del ADN del virus
Dos vías de trasducción bacteriana
- Muerte: Se introduce DNA de virus a membrana bacteriana. DNA bacteriano tiene DNA bacteriano y al replicar hace más virus. Al final se rompe membrana de bacteria y libera virus
- Acoplar virus al sistemaDNA se agrega a DNA de bacteria. Aunque tiene info de virus, esta sana y no lo replica.
Dos componentes que forman el DNA genómico de una bacteria
DNA cromosómico y plásmidos
La bacteria puede vivir sin DNA cromosómico
Falso
Plásmidos
Fragmento de DNA bacteriano, que pasa info de bacteria a bacteria como resistencia a antibióticos.
dsDNA
DNA de dos cadenas
Enzimas de restricción
Endonucleasas que cortan gen que se busca.
¿Cómo formar DNA recombinante?
- Se corta el gen deseado con enzima de restricción y se aisla. Al igual que el plásmido se corta en el sitio. Se unen y forman DNA recombinante.
- Se pasa plasmido con gen a la bacteria.
- La bacteria genera copias del plásmido, por ejemplo generar mucha insulina
¿Por qué se utiliza una bacteria en el DNA recombinante?
Tiene mayor capacidad proliferativa. Te puede producir mucha insulina
Bacteria principal para el DNA recombinante
E. colli, ya se conoce su ADN
Bacteriofago funcionamiento
Latente
- Virus inserta DNA
- Bacteria lo reconoce y lo corta
- Lo agrega al DNA cromosómico. Metila esa parte para que nose exprese (se dice que está latente)
Las enzimas de restricción son _______________________ para cada bacteria
Únicas
¿De dónde provienen las enzimas de restricción?
De bacterias que tiene capacidad de romper ADN que no es de bacteria (defensa en condiciones normales)
Enzimas de restricción
Son endonucleasas, que actua como defensa de bacterias cuando entra ADN foráneo (CAR-E)
Degradan AND extraño, no el propio
Pasos
Nomenclatura enzimas de restricción
1° - primera letra de género de bacteria E
2 y 3° - nombre de la especie co
4° Agrega letra o núm de acuerdo a cepa o serotipo R
5° Número romano de acuerdo a cronología en que se aislo V
EcoRV
Enzimas del sistema de modificación
Metilasas: modifica ADN propio para que no se degrade. Se metila en residuos de citocina o adenina. ADN metilado inmune
Protege de bacteriofagos
Enzimas de restricción I
- Corte asimétrico
- Corte lejos del sitio de reconocimiento (1000pb)
- Corte aleatorio, rio abajo o arriba
Enzimas de restricción II
- Secuencia palindrómicas
- sitio de reconocimiento = a sitio de corte
Enzimas de restricción III
- Asimétrico
- Corte lejos de sitio de reconocimiento (20 a 30 kb)
Secuencia Palindrómica
Arriba derecha izquierda= abajo izquierda derecha
Enzimas de restricción IV
Reconoce ADN metilado
¿Qué tipo de enzima de restricción es usada?
II, es específica
Diferencia entre corte cohesivo y romo
Cohesivo- asimétrico, en diferente posición (3 a 5 NT)
Romo - parejo, simetrico en mabas cadenas
¿Qué tipo de corte utiliza el DNA recombinante?
Cohesivo
¿Los fragmentos en el DNA se cortan con misma enzima de restricción?
Sí, deben ser complementarios
Like rompecabezas
¿Quien une finalmente el DNA recombinado?
La DNA ligasa genera enlaces fosfodiéster
DNA recombinante
Vectores
Molécula dsDNA que tiene capacidad de albergar un fragmento de DNA exógeno
Vector de clonación ejemplos
Plásmidos, bacteriófagos, fagémidos, cósmidos
Función y beneficio de vector de clonación
Almacena secuencias
Obtiene gran cantidad de DNA
Vector de clonación partes
- Origen de replicación
- Sitio múltiple de clonación (parte donde ira DNA complementario)
- Marcador de selección
Vector de clonación
Marcadores de selección
- Resistencia antibióticos
- Prote verde fluorescente
Vector de clonación
Función de marcador de selección
Ver que bacteria agarro el plásmido o DNA recombinante
Vector de expresión función/ ejemplo
Producir transcrito o proteínas
Plásmido o bacteriófago
Vector de expresión Partes
- Ori de replicación
- Promotor
- IRES sitio de entrada a ribosoma
- Sitio múltiple de clonación (donde se hace corte cohesivo)
- Secuencia Poli A
Vectores
Plásmidos
- dsDNA, circular
- En bacterias y levaduras
- Tamaño de gen a inserta: 20 kB
or, gen de resistencia antibiotica
Vector
Bacteriófago
Virus que infecta bacterias
* Se modifica genéticamente, elimina genes que no se requieren para replicación
* Tamaño gen a inserta: 25 kb
Vector
Cósmido
Se combina DNA de bacteriófago y un plásmido
* Plásmido: gen resistencia a los antibióticos, sitio Ori. Lo hace circular
* Bacteriofago: cos para empaquetar
* Tamaño gen a inserta: 50 KB
Bacteriófago
Ciclo lítico vs lisogénico
El ciclo lítico conduce a la muerte del huésped, mientras que el ciclo lisogénico conduce a la integración del fago en el genoma del huésped.
Vector
Fagémidos
Plásmido al que se le incorpora el origen de replicación de un fagos
Sin sitios cos, lo hace lineal
Vector
Cromosomas artificiales
BAC (bacterias)
YAC (levaduras
Muy grande
Vectores con el tamaño del gen a insertar
Menor a mayor
- Plásmido (20kb)
- Bacteriófago (25kb)
- Cósmido (50kb)
- Fagémido (100kb)
- BAC /YAC (>1000kb) cromosomas
Clonación molecular
Fin de DNA recombinante en cuanto a la transformación celular
Material gneético se incorpora extracromósomicamente, se replica, transcribe y traduce
Clonación
- Fragmento DNA introducido en plásmido
- Transformación de e. coli (bacteria)
- Células hijas tienen plásmido recombinante (vienen de clona)
Pasos de clonación molecular
- Se prepara inserto que se va a clonar (enzimas restricción)
- Preparar vector: cortar con ezima, desfosforilar vector, purifir plásmido
- Ligación del inserto (gen) y vector con ligasa
- Preparar células competentes (permeabilidad de membrana a aceptar vector con glicerol 10% o CaCl2)
- Transformación celular: adquiere gen exógeno, nuevo fenotipo de célula
- Identificar colonias celulares con vector recombinantes
