Manipulación de genes Flashcards
Las modificaciones de los genes son….
- Al Azar
- Variantes
- Ectópicas
- Inesperadas
¿Quiénes dan soluciones para modificar el genoma eucariótico?
La especie procarionte
Define que es la microinyección de DNA en prónucleos en los huevos fertilizados
Se inyecta el gen de interés en el prónucleo masculino de un animal donado.
Se inserta antes de la primera división celular de tal modo que todas las células del animal contienen el gen
Pasos para microinyección de DNA en prónucleos
- Identificar el gen de interés
- Inserta el gen en el vector adecuado
- Microinyección de DNA dentro del pronúcleo masc de un huevo.
- Implantación del huevo microinyectado en un madre alquiler
- Desarrollo de embrión hasta nacimiento
- Ver si se incorporo el gen (expresión)
¿Dónde se integrará el nuevo gen?
Donde quiera, el promotor elegido ayuda expresar el nuevo gen
¿Para qué se usa la microinyección en prónucleo?
Crear animales transgénicos
* Que ayuden a estudiar un gen en una patología
* Hacer transplantes
Problemas de la microinyección de DNA en prónucleos
- Sobreviven pocos huevos
- El gen se inserta al azar en los cromosomas
- No todas las células del animal reciben el gen
- El gen no se expresa lo suficiente
Define la modificación genética en células madre embriónicas
Las células madre embriónicas se aislan y se le pone vector con DNA. Se escoge la que tenga el plásmido y se vuelve a poner en blastocisto.
¿De dónde se obtienen las células madre embriónicas?
Del blastocito
Pasos de la modificación génetica en las células madre embriónicas
- Célulad madre se obtiene de blastocisto
- Se mantienen las células en cultivo con factores que inhiben su diferenciación
- Se manipulan con recombinación homóloga
- Se reintroducen en blastocisto
¿Qué produce la modificación genética en células madre embrionarias?
Descendencia con mosaicismo
Clonación
Transferencia de núcleo a célula plasmática
Describe la clonación
Se utiliza el núcleo de una célula somática y el óvulo sin núcleo. (en etapas G0_/G1).
Se inserta en un útero, empieza fusión y luego división celular hasta formar un embrión
¿Por qué no funcionó la clonación en la oveja Dolly?
La célula estaba vieja con menor cantidad de telómeros.
Crispr
Clustered interspace short palidromic repeats
Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmennte interespaciadas
Cas
Proteínas como endonucleasas asociadas a CRISPR
CRISPR
Las secuencias repetitivas se encuentran en bacterias separados por espaciadores (de bacteriofagos)
Proceso de generar CRISPR-CAS
- Pequeños fragmentos de DNA viral o plásmidos se incorporan al génoma bacteriano con muchas secuencias palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas
- Se transcribe y genera un RNA no codificante, (pre-cRrna) que se procesa mediante proteínas Cas
- Se forma el crRNA maduro con Cas II
- Se forma cada complejo CASIII+ secuencia palindromica+gen fago
- Ensamble de proteína Cas y el crRNA dividido
Pasos de formación CRISPR-CAS
- Enzimas de restricción de bacteria incorporan el plásmido o DNA viral en DNA cromosómico de bacteria
- CRISPR ahora sera secuencia FAGO+ secuencia palindrómica (repetidas veces)
- La estructura es RNA de unión, CAS y luego CRISPR
- Como esta estructura es DNA se transcribe
*Se forma RNA de unión, RNA CAS y RNA CRIPSR
*Esto se modifica fromando RNA de unión, proteínas CAS, y cortando CRISPR en pedazos de secuencia palindrómica-FAGO
*Ahora RNA de unión une CAS con un pedazo CRISPR
Función complejo CRISPR-CAS en bacterias
- Fago mete su DNA viral
- Cél tiene complejo CRISPR-CAS, con secuencias igual al DNA vírico
- CAS actua com endonucleasa, ya que bacteria tiene info y no quiere volver a infectarse.
- Se corta el nuevo DNA insertado
Diferentes funciones de proteínas CAS
- Endonucleasas
- Unir a CRIPSR
- Muchas funciones
- Une DNA de fago a CRISPR
Crispr-Cas9
Manera de manipular el genoma sin alterar la secuencia genética subyacente
Función de Cas 9
No tiene función de endonucleasa
* Desaminar nucleótidos es decir en citocina a uracilo. Mutar gen para crear diferentes proteínas
* Activador o represor
* Expresar genes o promover la transcripción
Aplicaciones CRISPR-CAS 9
- Silenciar ciertos genes
- Modificaciones en metabolitos secundarios
- Sobre expresar un gen para producir de mas un producto deseado como la insulina
- Etiquetar ciertos genes
- Regulación de ciertos genes por señales de estrés o trasducción
Desventajas de CRISPR-CAS9
- Generar mutantes
*
¿Cómo localizar una secuencia en el gen?
Fluroforo
Aplicaciones médicas CRISPR-CAS9
- Permitir el desarrollo de terapias génicas (modificar Gen dmd que codifica para distrofina y aliviar la atrofia de músculos proximales en la distrofia muscular de Duchenne)
- Terapia celular (modificar células ex vivo para introducirlas, enfermedad Parkinson, Huntington)
- Terapia células madres (inducir diferenciación como regenerar tejido miocárdico en cardiopatía isquémica)
