PCR Flashcards
Ventajas y desventajas de la PCR
Ventajas - rápido, gran variedad de reactivos, no necesitan al agente viable, mayor sensibilidad y especificidad. Otras utilidades; bacterias de difícil aislamiento y antibiograma, también podemos buscar genes de resistencia e inferir.
Desventajas - no aíslo al microorganismo, gran inversión inicial, el resultado final debe coincidir o confirmar con la clínica. Que no se detecte no descarta y que se detecte no confirma.
Generalidades de la PCR
Técnica de diagnóstico directo
Sirve para amplificar un fragmento de ADN de forma exponencial a partir de una muestra.
Cómo se hace la extracción de ácidos nucleicos
Por métodos de lisis térmica o química.
Ej. Trizol - cloroformo
Componentes de la PCR
- TAQ polimerasa - pone las bases
- dntps - nucleotidos/bases
- Primers - forward y reverse, 15 - 20 pb, específicos.
- Buffer
- ADN muestra
Fases de cada ciclo de la PCR
- Desnaturalización - 94 grados, se separan las hebras
- Hibridación - 55 grados, se pegan los primers por complementariedad de bases
- Extensión - 72 grados, actúa la TAQ polimerasa y repara el ADN, pone las bases complementarias.
Cuantos ciclos se hacen para la PCR
Generalmente 35 - 45 ciclos
Cómo se visualiza la PCR?
Detección en geles de agarosa (electroforesis), la electroforesis es la técnica de separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico, la migración de las moléculas depende del tamaño de ampliación y el tamaño del poro.
Se utilizan agentes intercalantes, se pone en el gel, al excitarlo con luz UV se ve. Usar transiluminador.
Adaptaciones de la PCR
- RT PCR
- Real time PCR
- PCR anidada
- PCR múltiple
- Digital PCR (tercera generación)
Para qué se usa la RT PCR?
Tiene retrotranscriptasa inversa y sirve para muestras ARN. El mix tiene random primers u oligodt primers + RT. Hay una fase + en la que el ARN pasa a ADN.
Para qué sirve la Real Time PCR?
Cuantifica el ADN mediante la detección de una señal fluorescente, la que incrementa directamente la cantidad de ampliaciones producidos en cada ciclo de PCR. Termociclador con laser que detecta cuanto ADN se forma.
para que se usa la PCR anidada?
Dos pares de primers, se hace en dos etapas. 1 PCR con un par de primers y luego otra PCR con otro par de primers sobre el primer fragmento ya amplificado. Presenta mayor sensibilidad y especificidad en diagnóstico.
Para que se usa la PCR múltiple?
Dos o más pares de primers. Utilizada para el diagnóstico de enfermedades causadas por diferentes agentes. Por ej. abortos en bovinos.
Para qué se usa la Digital PCR?
Se visualiza como gotitas, la mix se divide en miles de partículas y cada una de esas gotitas tiene una molécula de TAQ polimerasa, nucleotidos, primers y hebra de ADN. Se visualiza en gotitas positivas y negativas, luego se cuantifica.
Que se podría hacer con el producto de la PCR?
Se puede hacer secuenciación, el producto de PCR se pasa por un equipo Sanger y detecta las terminaciones de cada fragmento y nos dice que secuencia tiene. Sirve para estudiar epidemiología molecular.
