PCR

Question 1

Hay 2 tipos

Answer 1

Cualitativa (fundamentos) y cuantitativa (tiempo real)

Question 2

Tecnologia inovadora del mundo
Sirve para conocer cantidad de acidos nucleicos
Resultados confiables en poco tiempo
Alta sensibilidad, reproductividad

Answer 2

PCR

Question 3

Fundamentos

Answer 3

Reaccion enzimatica (ADN polimerasa)
Gracias a ella sintetiza naturalmente el ADN en las celulas

Question 4

Cuales son los 2 tipos de ADN

Answer 4

ADN genomico: PCR
ADN complementario del RNAm: RT-PCR (transciptasa reversa)

Question 5

Cuando se usa el ADN complementario

Answer 5

Para algun gen de interes

Question 6

Elementos principales

Answer 6

Molde
* Enzima: desoxirribonucleotidos trifosfatos y magnesio
* Oligonucleotidos primers: buffer, H20

Question 7

Etapas de la PCR

Answer 7

1. Desnaturalizacion
2. Hibridacion
3. Extension

Question 8

Aparato utilizado en la PCR

Answer 8

Termocicladores: establece sistema homogeneo en donde la temperatura y tiempo no se modifiquen en cada uno de sus ciclos

Question 9

Que pasa al final de la reaccion

Answer 9

Se debe corroborar si se amplifico el blanco de interes (AMPLICONES) y son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reaccion fue exitosa

Question 10

Cual es la enzima mas usada

Answer 10

Taq ADN polimerasa (viene de Thermus aquaticus), es termoestable

Question 11

Que son los primers

Answer 11

Secuencias de oligonucleotidos que delimitan la secuencia blanco que desea amplificar y son complementarios a esta

Question 12

Tamaño de primers

Answer 12

15-25 pares de bases y la cantidad G-C no debe de exceder 55% de la secuencia

Question 13

Cuales son las 2 secuencias de primers

Answer 13

Sentido/forward y antisentido

Question 14

Desnaturalizacion

Answer 14

ADN calentada y separadas a 95º por 20-30 seg
Tiempo depende de concentracion G-C (proporcional)

Question 15

Hibridacion

Answer 15

Se alinean primers en 3’
Temperatura 50-60º
Diseño de primers y temperatura correcta = especificidad y estabilidad del complejo sera eficiente

Question 16

Extension

Answer 16

Taq-polimerasa actua sobre complejo templado-primers, agrega dntps’ complementarios para hacer cadenas completas de ADN
Extension de cadenas es en direccion 5’ a 3’
Temperatura: 72º
AL final del ciclo: amplicones

Question 17

Analisis

Answer 17

Se usa gel de agarosa
Electroforesis: separa moleculas a gtravez de matriz solida que funciona como filtro para separar moleculas en un campo electrico
La separacion se hace bajo un buffer/tampon
Grupo fosfato da carga - (migra a lado +)

Question 18

PCR en tiempo real

Answer 18

• Cuantifica secuancias especificas de a.n usando reporteros fluorescentes en la reaccion
• Detecta los productos amplificados en cada ciclo de la reaccion
• Permite cuantificar la cantidad de ADN en la muestra
• Producto de amplificacion: no necesita uso de gel

Question 19

Aplicaciones PCR tiempo real

Answer 19

Saber cantidad ARNm de celulas o tejido
Aun con pequeña cantidad se garantiza alta sensibilidad, especificidad y eficiencia

Question 20

Ingredientes PCR

Answer 20

Mismo que PCR pero se le conoce como Master Mix, el agua va por separado y es libre de nucleasas
Pares de bases: 100-150

Question 21

Uso de termocicladores ademas de lo de temperatura y tiempo

Answer 21

Excita sistema de fluoresencia
Captura señal de emision del mismo
Analisis cuantitativo

• Su diferencia es la fuente de energia y la velocidad

Question 22

Como se analizan los resultados

Answer 22

Termociclador tiene software que genera graficas (muestra curso y progreso y otra la disociacion que muestra la especificidad de la reaccion)

Question 23

La cuantificacion puede ser

Answer 23

Absoluta: numero exactoi de copias amplificadas (para medir carga viral o bacteriana en diferentes tejidos)
Relativa: evaluar cambios de expresion de genes en distintos estados fisiologicos (gen blanco vs gen de referencia)

Question 24

Despues de la electroforesis que sigue

Answer 24

no se que de carga

Question 25

Bases de datos

Answer 25

Formato Fasta: primera

Question 26

Bases de datos primarias

Answer 26

Primarias: ENA, DDBJ y GenBank
Describen la secuencia, nombre cientifico, taxonomia del organizmo de procedencia y tabla que identifica regiones codificantes

Question 27

Bases de datos secundarias

Answer 27

• Bases de datos verificados y no redundantes
• Info adicional: caracterizacion, mutaciones, analisis polimorfismos, estudios de expresion y analisis comparativos

RefSeq esta en NCBI (ejemplo)

Question 28

Proteinas

Answer 28

Usa Swiss-Prot (viene de UniProtKB)

Question 29

Fuentes de las secuencias de proteinas en UniProtKB son varias:

Answer 29

Secuencias codificantes traducidas de la base de datos de secuencias de nucleotidos
Datos procedentes …

Question 30

Bases de datos secundarias

Answer 30

foto

Question 31

Alineamiento de secuencias

Answer 31

Globales: toda la longitud de la secuencia
Local: region de similitud dentro de secuencias largas que son diveregentes en el resto de su longitud

Question 32

Alineamiento mas utilizado

Answer 32

BLAST: compara secuencias de nucleotidos o aminoacidos (es mas para alineamiento local)

Question 33

Uso de los alineamientos

Answer 33

• Identificación de secuencias problema
• Identificación de motivos funcionales
• Identificación de mutaciones
• Anotación de genomas

Question 34

Programas de comparación de secuencias y alineamiento más empleados por los científicos son…

Answer 34

BLAST

Question 35

… permite a un investigador comparar una secuencia de consulta con una biblioteca o base de datos de secuencias e identificar secuencias de esa base que se asemeja a la secuencia de consulta por encima de un cierto umbral.

Answer 35

BLAST