Molekulare Tierzüchtung Flashcards
Wie werden Erfolge in der LW beeinflusst?
Wirtschaftliche, gesundheitliche, ökonomische und ökologische Erfolge in der LW werden beeinflusst durch:
- Management
- Fütterung und Haltung
- Tiergesundheit
- und dann erst durch die Zucht
Definitionen der Zucht
- Zucht bedeutet, die Gesetzmäßigkeiten und Möglichkeiten der Vererbung zu nutzen
- Zucht ist die Basis für eine nachhaltige Verbesserung des Leistungspotentials
Ziele der Tierzucht:
- Erzeugung hochwertiger Produkte
- mit gesunden und stress-resistenten Tieren
- unter tiergerechten Haltungsbedingungen
- bei optimaler Nutzung genetischer Ressourcen
Methoden der Biotechnologie
- Genetik
- klassische Genetik
- molekulare Genetik
- Gentechnologie
Methoden der Biotechnologie, Ziel
Methoden der Biotechnologie können dazu beitragen, Zuchtziele schneller und besser zu realisieren
Definition Genetik
Genetik ist die Wissenschaft von der Vererbung, reicht von Viren über Mikroorganismen, Pflanzen, Tiere bis zum Menschen, grundsätzliche Vorgänge sind überall gleich
Definition klassische Genetik
befasst sich mit Phänomenologie der Vererbungsvorgänge
Definition molekulare Genetik
versucht, die allen Vererbungsvorgängen zugrunde liegenden Prinzipien auf molekularer Ebene zu beschreiben und zu erklären
Definition Gentechnologie
liefert Möglichkeiten, Vererbung gezielt zu beeinflussen und Erbinformationen sogar speziesübergreifend zu verändern
Ebenen der Tierzuchtarbeit
1- Phänotyp: sichtbare Merkmalausprägung, umweltbeeinflusst klassische Genetik, Populationsgenetik
2 - Biochemische Ebene: Stoff- und Energiestoffwechsel, Vermittlung Gen-Merkmal, Züchtungsbiologie
3- Genotyp: Struktur, Funktion, Veränderung genetischen Materials, Molekulargenetik
Definition Vererbung
Vererbung ist die Weitergabe von Erbanlagen (Genen) von einer Generation an ihre Nachkommen, die bei diesen ähnliche Merkmale/Eigenschaften wie bei den Vorfahren bewirken
Materielle Grundlage der Erbanlage…
…ist die DNA
Definition Genetik
Wissenschaft, die sich mit Struktur, Funktion und Regeln der Vererbung befasst
Die eukaryotische (tierische) Zelle enthält:
- Zellkern (Nucleus) mit Kernmembran
- Mitochondrien
- Ribosomen
- ER
- Golgiapparat
- Zytoplasma und Plasmamembran
- Lysosomen, Perisomen, Exosomen, u. a. Kompartimente
Zellkern und Mitochondrien enthalten…
… DNA
Das Genom
- ist die Gesamtheit des DNA-Gehalts einer Zelle
- besteht bei Tieren aus Autosomen, Sex-Chromosomen (Heterosomen) und mitochondrialer DNA
somatische Zellen
zwei Genomkopien = diploid, 2n
Gameten, Keimzellen
nur eine Genomkopie = haploid, n
Nucleus enthält…
Chromosomen
= chromosomales Genom
= großes Genom
Chromosomen bestehen zu…
- 40% aus einem DNA Faden
- 40% aus Histonen
- 20% aus weiteren Proteinen
Chromosomen sind…
- Kompakt, da kondensiert, bei Zellteilung, nur 2um lang
- Diffus als Chromatin in Zellruhe, bis zu 5cm lang
In der Metaphase…
… hat ein Chromosom zwei Chromatiden
Telomere
- Chromosomenenden
- Schützen vor Stückverlust
Zentromer
- Einschnürung
- hält Chromatiden zusammen
- apozentrisch ^
- metazentrisch x
Hühner haben..
- Makrochromosomen (8 Paare + 2 Sex Chr.) und Mikrochromosomen (30 Paare)
- Mikrochromosomen enthalten eine 2x bis 4x höhere Gendichte als Makrochromosomen
haploid
Sätze: 1 Satz, je 1 Chromosom
Name: n
Vorkommen: Keimzellen
Entstehung: Meiose
diploid
Sätze: 2 Sätze je 2 Chromosomen
Name: 2n
Vorkommen: Körperzellen
Entstehung: Mitose
polyploid:
Sätze: mehrere
Name: 4n, 8n
Vorkommen: Leberzellen
Entstehung: Endomitose
Pferdespulwurm, Parascaris equorum
2n: 2
Schwein, Sus scrofa
2n: 38
Schaf, Ovis ammon
2n: 54
Rind, Bos taurus (30 Paare)
2n: 60
Pferd: Equus caballus
2n: 64
Krabbe, Eupagurus ochotensis
2n: 254
Chromosomen sind…
.. die stoffliche Basis der erbinformation
- Nucleotide als Informationseinheit (Basenpaar = bp)
- Gesamtgenom beim Säuger: ca. 3.000.000.000 bp
- Größte Säugerchomosomen: ca. 160.000.000 bp
Chromosomen unterscheiden sich…
… durch Informationsgehalt
- nur ca. 5% des Genoms verschlüsseln Baupläne = Gene
- Säugetiere haben ca. 20.000 Gee
Mitochondrien (mtDNA)
- kleines, extrachromosomales Genom: 15-20kb (zirkulär)
- befinden sich im Zellplasma (500 bis 1.500 Stück)
- in die Energiebereitstellung eingebunden
- werden fast nur über Mutter mit Eizelle weitergegeben
- haben 37 Gene (Säuger)
- Veränderungen (Mutationen) lassen in der mütterlichen Familie rückverfolgen zur “Urmutter” bzw. Analyse der Verbreitung der Arten
Formen der Zellteilung
A) Mitose = Entstehung diploider Körperzellen
B) Meiose = Entstehung haploider Keimzellen
Voraussetzung Zellteilung
- immer, in der Interphase
- identische Verdopplung des Chromosomensatzes (Replikation)
- Chromosomen liegen dann als verbundenes Paar von zwei identischen Chromatiden vor
- Gewährleistet die Konstanz der Erbinformation
Crossing over in der Meiose
- kurze Chromosomen rekombinieren 1x, lange oft 2x
- führt zu Neukombinationen der Allele
Abfolge Crossing over
- Zwei homologe Chromosomen mit ihren zwei Chromatiden
- Überlappung von Chromatiden unterschiedlicher, aber homologer Chromosomen => Kopplungsbruch
- Homologe Chromosomen mit ausgetauschten Chromatidenstücken
Vergleich Meiose - Mitose: Prophase
gleich
Vergleich Meiose - Mitose: Metaphase
Mitose: Chromosomen mit Chromatiden wandern zum Äquator
Meiose: Chromosomen paaren sich am Äquator, Crossing over
Vergleich Meiose - Mitose: Anaphase
Mitose: Chromatiden trennen sich, wandern zu den Polen
Meiose: homologe Chromosomen mit Chromatiden wandern zu den Polen
Vergleich Meiose - Mitose: Telophase
Mitose: Chromatiden erreichen Pole
Meiose: Chromosomen erreichen Pole
Vergleich Meiose - Mitose: 2. Teilung
Mitose: Doesn’t excist
Meiose: nun erst werden die Chromatiden getrennt
Vergleich Meiose - Mitose: Ergebnis
Mitose: zwei identische diploide Körperzellen (2n)
Meiose: vier unterschiedliche haploide Gameten (n)
Zusammenfassung Zellteilung
- Identische Replikation vervielfältigt die Erbinformation
- Ergebnis: zwei gleiche Tochterstränge (Chromatiden)
- Mitose und Meiose sind Formen der Zellteilung:
- bei Mitose teilen sich die Chromatiden; Ergebnis: zwei identische Zellen mit diploiden Satz (2n) = Körperzellen
- Bei Meiose gibt es zwei Zellteilungen (in der ersten Teilen sich die Chromosomen und in der zweiten die Chromatiden); Ergebnis: vier unterschiedliche Zellen mit haploiden Satz (n) = Keimzellen
Gesetzmäßigkeiten Vererbung
- vom Augustinermönch Gregor Mendel augestellt (1865)
- viele Beobachtungen an Erbsen
- drei Regeln, die grundsätzliche bis heute gelten
Allgemeine Schlussfolgerungen Mendel
- Merkmalsvererbung beruht auf Einheiten/Genen, die unverändert, die unverändert auf Nachkommen überragen werden (von jedem Eltern eine)
- Erbanlage muss nicht sichtbar werden, kann aber auf nächste Generation übertragen werden (rezessiv)
- beim addieren/intermediären Erbgang addieren sich Effekte beider Allele
Basiseinheit der Vererbung…
… ist das Gen
- Jedes Individuum ererbt zwei Kopien jedes Gens, eine von der Mutter, die andere vom Vater
- Varianten des Gens (Zustandsformen) sind Allele
- Merkmalsausprägung braucht immer zwei Allele
- Allelvariationen entstehen durch Mutationen
Organismen sind immer nur für ein Gen..
- Reinerbig = homozygot (AA), beide Allele sind gleich
- Mischerbig = heterozygot (Aa), beide Allele eines Gens zeigen Unterschiede, führen zu unterschiedlichen Eiweißen
Uniformitätsregel = 1. Mendelsche Regel
- Kreuzt man homozygote Individuen (P = Elterngeneration, Parentalgeneration), die sich in einem Merkmal unterscheiden, entsteht in der 1. Generation (F1 = Tochtergeneration) eine genotypisch und phänotypisch einheitliche (uniforme) Nachkommenschaft
Spaltungsregel = 2. Mendelsche Regel
Werden Produkte (Nachkommen) aus der F1-Generation miteinander gekreuzt, sind die entstehenden Individuen nicht einheitlich. Sie spalten in Bezug auf das mischerbige Allelpaar in bestimmte Verhältnisse auf
Unabhängigkeitsregel = 3. Mendelsche Regel
Bei der Kreuzung von homozygoten Individuen, die sich in mehr als einem Merkmal unterscheiden, werden die einzelnen Gene unabhängig nach dem ersten beiden Regeln vererbt. Es können Individuen mit Neukombinationen entstehen.
Mendelsche Vererbungsmuster
- Phänotypen bzw. Merkmale, die ihre Ursache in Mutationen in einem einzelnen Gen haben
- Varianten: autosomal dominant-rezessiv, autosomal intermediär/additiv, Geschlechtschromosomen gekoppelt (X-linked, z-linked) dominant-rezessiv
Lethal White Foal Syndrom (LWFS)
- Rezessiver Erbdefekt (mit additiven/intermediären Effekt)
- Mutation im EDNRB-Gen
- OVOV: gesunde, einfarbige Pferde
- OVov: gesunde, aber gescheckte Pferde (Overos), Anlageträger
- ovov: weiße Pferde (taub, blaue Augen), keine Farbzellen, ohne Darmperistaltik (Megacolon), tödlich
Geschlechtsvererbung wird geregelt über…
…die Heterosomen
Trennung Mammalia und Vögeln…
…vor 300-350 Mio. Jahren
- Ausprägung des männlichen Geschlechts bei Säugern, Y-Chromosom mit SRY-Gen (Wichtiges Gen für männlichen Phänotyp, codiert Hoden-determinierenden Faktor = TDF)
- Ausprägung des männlichen Geschlechts bei Vögeln, Gen für Geschlecht auf Z-Chromosom => doppelte Dosis führt zum männlichen Phänotyp
- Säuger M: XY
- Säuger W: XX
- Vögel M: ZZ
- Vögel: WZ
Geschlechtschromosomen gekoppelte Vererbung
- x-gekoppelte (x-linked) Merkmale entstehen durch Mutationen auf dem X Chromosom (= Z Chromosomen beim Vogel)
- Dominant x-gekoppelte Mutationen beeinflussen alle männlichen und weiblichen Träger
- x-gekoppelte rezessive Merkmale erfordern: zwei Kopien des defekten Gens beim weiblichen, aber nur eine Kopie beim Männchen, da diese nur ein X haben
Geschlechtschromosomen gekoppelte Vererbung - Hund
- x-chromosomale Hämophilie B (Blutgerinnungsstörung)
- Mangel am Faktors IX, führt zu Blutungsneigung
- Bei Rhodesian Ridgeback ca. 5% heterozygote Anlageträger (auch bei Hovawart und anderen Rassen)
- Rüden relativ häufig betroffen als Hündinnen, da ein X-Chromosom
- Hündinnen mit einem Defektallel erkranken nicht, geben es aber weiter (Konduktorinnen)
- Hündinnen erkranken, wenn beide X-Chromosomen mit der Mutation behaftet sind
Geschlechtschromosomen gekoppelte Vererbung - Huhn
- Zwergwuchs - mehrere Mutationen im Wachstumshormon-Rezeptor-Gen (dw) auf dem Z-Chromosom
- dw-Linie beim Masthuhn:
- Quelle für weibliche Elterntiere für Mastkükenproduktion
- Haben reduzierten Futterverbrauch, brauchen weniger Raum, sind ökonomisch effizienter als normale Broilerlinie
- Anpaarung an Männchen normaler Broilerlinie
Nicht-mendelsche Vererbung…
… zeigt andere Muster
- genetische Kopplung von Genen
- Interaktion zwischen Genen und Allelen
- Einfluss des Geschlechts auf den Phänotyp (Hornbildung)
- Mitochondriale Vererbung (nur mütterlich)
- Genetisches Imprinting (Epigenetik)
Genetische Kopplung von Genen
enge Nachbarschaft von Genen auf einem Chromosom, beide Gene und ihre spezifischen Allele werden mit hoher Wahrscheinlichkeit zusammen vererbt
Interaktion zwischen Genen oder Allelen
- unvollständige Penetranz
- Locus-Heterogenität
- Allel-Heterogenität
unvollständige Penetranz
Wahrscheinlichkeit, dass Genotyp auch als Phänotyp sichtbar wird (=Penetranz), ist selten 100%, also unvollständig (oft altersabhängig)
Locus-Heterogenität
Mutationen in verschiedenen Genen führen zu identischem Phänotyp
- Spinnengliedrigkeit: Mutation im Molybdän-Kofaktor-(Fleckvieh) bzw. Sulfit-Oxydase-Gen (Braunvieh)
Allel-Heterogenität
mehrere Mutationen im gleichen Gen verursachen identische Phänotypen (Myostatin-Gen beim Rind, KIT-Gen beim Pferd)
Genetisches Imprinting (Epigentik)
Gene werden in Abhängigkeit ihrer Herkunft (Vater oder Mutter) unterschiedlich exprimiert (Maultier, vorn, Maulesel)
Zusammenfassung - Gesetze
- Immer zwei Allele (Zustandsformen der Gene) sind für die Merkmalsausbildung erforderlich
- Mendel stellt 3 Vererbungsregeln auf (Uniformitätsregel, Spaltung, Unabhängigkeit)
- Geschlecht vererbt sich 1:1
- Sonderformen scheinen im Widerspruch zu Mendelschen Regeln zu stehen, sind es aber nicht
Variabilität durch:
- Mutationen
- Rekombination bei der Meiose
- Sexuelle Fortpflanzung
- Fluktation, Migration, Kreuzung (Populationsgenetik)
Mutationen (DNA-Ebene)
- Evolutionsfaktoren
- schaffen neue Variabilität
- Verändern Zusammensetzung des Genoms
Rekombination bei der Meiose:
- Neuverteilung des vorhandenen Erbgutes, keine Veränderung
- Folgen: zwei identische Nachkommen können fast nie entstehen, wichtige Grundlage für genetische Variabilität
- Formen: Intrachromosomal, Interchromosomal
Intrachromosomale Rekombination:
(in der Prophase) Rekombination zwischen homologen Chromosomen durch crossing over, partieller Austausch, partieller Austausch der Chromosomen von Vater und Mutter
Interchromosmale Rekombination:
(in Metaphase, Anaphase)
- Zufällige Verteilung der homologen Chromosomen auf die neuen Zellen, zufällige Kombination von mütterlichen u. väterlichen Chromosomen
sexuelle Fortpflanzung (Genomebene)
Zufällige Vereinigung von einer Eizelle und einem Spermium mit jeweils zufälligen Informationsgehalt
Genomanalyse
- Aufklärung der Struktur und Funktion der DNA-Sequenz (speziell der Gene)
- Untersuchung des Verhältnisses zwischen genetischer Variation und phänotypischer Variation
- Aufklärung der genomischen Struktur und Variabilität als wesentliche Voraussetzung für die Aufklärung der Funktion von Genen
DNA-Struktur
- Räumliche Struktur der von Watson/Crick ermittelten Form (B-DNA) zeigt in einer Wendung der Doppelhelix 10 Basen im Bereich von 3,4nm
- Durchmesser der rechtsgewundenen Helix: 2nm
- beide Polynucleotidketten sind um eine Achse gewunden
- B-DNA ist voll hydratisiert
- hat große und kleine Furche
- DNA meist doppelsträngig
- Nur C-G oder A-T können einander gegenüberliegen (komplementäre Basen)
- Zwischen C-G liegen drei, zwischen A-T zwei Wasserstoffbrücken (Basenpaarung)
- Nach Konvention werden DNA-Sequenzen immer von rechts gelesen und mit dem 5’-Ende begonnen
Genomorganisation beim Tier
- Einzelkopie-DNA und repetitive DNA im Wechsel
- Gene: für ein Eiweiß kodierende Bereiche
- LINE: ling interspersed repetitive sequences (>6.000 bp, 20% des Genoms)
- SINE: short interspersed repetiive sequences (>3000bp, 15% des Genoms)
Gen-Struktur
- Gen: proteincodierende Chromosomenbereiche
- meist in Exons und Intrins unterteilt, außer mitochondrialen und einzele Kern-Gene
- Exon: codierende Sequenz
- Intron: nicht codierende Sequenz
- Regulatorische Elemente: regulieren Gen-Aktivität
Expression:
Transkription + Translation
Transkription
- Ablesen der Gensequenz am Gegenstrang, größeres primäres RNA-Molekül entsteht
- Modifikation durch Enzyme: 5’-Cap, Poly-A-Schwanz
- Introns durch Spleißen bzw. 5’/3’-Überhänge werden entfernt
- “reife” mRNA durch Kernmembran ins Cytoplasma, dort Translation
Translation
- an den Ribosomen
- Einteilung in Tripletts, daher 64 Codons
- gibt nur 20 AS => genetischer Cod ist degeneriert
- aber weniger tRNAs: A:U/G:C-Paarung an der 3. Position (“wobble”) nicht so streng
Zusammenfassung - Struktur/Funktion
- DNA besteht aus einem Rückgrat (Ribose und P-Rest) sowie 4 Basen, die über Wasserstoffbrücken zu einer Doppelhelix verbunden sind
- Vier Basen speichern Information = genetischer Code
- Drei Basen (Triplett) codieren eine der 20 AS, nur die Tripletts mit 64 Varianten ermöglichen eindeutige Codierung = Worte des Codes
- Verkettung der AS in der vorgegebenen Reihenfolge führt zum Eiweiß, dem Satz
- Transkription und Translation sind die beiden wichtigsten Stufen der Genexpression
Methoden zur Erfassung der genomischen Struktur/ des Genotyps
- Isolation der DNA
- Vervielfältigung der DNA durch PCR
- Sequenzierung zur Struktur- und Mustererkennung
- Genotypisierung
Methoden zur Bewertung des Phänotyps
Bsp.: Vergleich von Genotyp und Phänotyp
- Berechnung von Alleleffekte
- Haplotypenbildung usw.
DNA Isolierung
- DNA kann aus allen Zellkern enthaltenden Zellen (Blut, Haare, Sperma, Muskel, Speichel, usw.) isoliert werden
- Allgemeine Schritte:
1. Zellaufschluss (Lyse) zur Freisetzung der DNA mit Proteinase K
2. Trennung der DNA von Proteinen (Histone, Zellbestandteile)
3. Fällen und Waschen mit Ethonal
4. Lösen der DNA in Puffer
Varianten DNA-Isolierung
Verfahren sind zahlreich mit vielen Varianten
- klassische Phenolextraktion (heute selten)
- KIT-Verfahren
- Extraktion mit hochmolekularen Salzlösungen
DNA-Amplifikation
Prozess der in vitro-Vermehrung von DNA-Fragmenten mittels Polymerase (PCR)
- nutzt zwei Eigenschaften/Vorgänge:
- Ablauf der natürlichen, identische DNA-Replikation
- Denaturierung (Hitze, >90°C) und Renaturierung/Hybridisierung (Abkühlung)
PCR-Ablauf (Grundzyklus)
- Öffnen der Wassersstoffbrücken durch Hitze (Denaturierung)
- Anlagern der Primer an Zielsequenz (Annealing)
- Strangaufbau durch Polymerase (Elongation)
- Wdh. des Grundzyklus 25-35x
- Ergebnis: ca. 5 Mio Kopien des DNA-Bereiches
Bestimmung der Basen-Reihenfolge in der DNA-Kette
Viele unterschiedliche Methoden:
- Kettenabbruch-Synthese (Sanger-Methode)
- Pyrosequenzierung
- Solexa-Technologie
- Sequenzierung durch Ligation
Kettenabbruch-Synthese (Sanger-Methode)
- Einbau von farblich markierten ddNTPs (Terminatoren) führt zum Kettenabbruch
- Wellenlänge der farblich markierten Abbruchnucleotide wird gemessen
- robustes, schnelles und einfaches Verfahren
- Auftrennung durch Gelelektrophorese
- Laser misst Wellenlänge der vier markierten ddNTPs
- Sequenzierlänge: 500-1200b
NGS = NextGenerationSequencing
- Solexa-Technologie (Illumina, zB. HiSeq 4000)
- Anreicherung
- Sequenzierung
- Auswertung
NGS = NextGenerationSequencing: Anreicherung
- Erstellen einer Library (DNA-Fragmente bekommen Adapter)
- Vervielfältigung der Fragmente und räumliche Trennung über bridge PCR (DNA-Fragmente binden auf einer mit Primern gespickten Oberfläche und werden in mehreren PCR-Zyklen lokal angereichert)
NGS = NextGenerationSequencing: Sequenzierung
- Einbau eines farbig markierten Nucleotids, Abbruch der weiteren DNA-Synthese
- Aufnehmen des Farbmusters an der Reaktionsoberfläche
- Entfernung des Terminators und weiterer Strangaufbau, Fortsetzung der Sequenzierung
Zusammenfassung Techniken
- molekulare Techniken umfassen ein riesiges Spektrum zur Analyse des Genoms
- DNA kann aus allen kernhaltigen Zellen mittels verschiedener Methoden entnommen werden
- PCR ist eine Basistechnik zur in-vitro-Vermehrung von DNA-Stücken, die fast allen weiteren Untersuchungen vorangeschaltet ist
- Durch Verfahren der Sequenzierung wird di Reihenfolge der Nukleotide im Genom ermittelt
- Sanger-Sequenzierung ist klassisches Sequenzierungsverfahren , heute oft NGS= NextGenerationSequenzing genutzt
