Genetisch modifizierte und geklonte Tiere Flashcards
1
Q
GMO/GVO
A
genetisch modifizierter Organismus/genetisch veränderter Organismus
2
Q
Transgen
A
Fremd-DNA, die durch gentechnische Methoden in Organismus eingeführt wird
3
Q
Gentransfer
A
Übertragung in-vitro kombinierter DNA (Labor-Genkonstrukt) in eine Empfängerzelle
4
Q
Transgener Organismus
A
Organismus mit fremder oder modifizierter DNA
5
Q
Nutzung der GMOs für:
A
- Grundlagenforschung
- Leistungsverbesserung bei Nutztieren
- Veränderte Proteinzusammensetzung “functional food”
- Herstellung therapeutisch wirksamer Proteine/Peptide (Bioreaktor)
- Gentherapie für Mensch und Tier
- Tiere als Organspender (Xenotransplantation)
6
Q
Gundlagenforschung
A
= Funktionsbestimmung von Genen
- Erstellen von Knock-Out-(KO)-Tieren, denen ein bestimmtes Gen fehlt oder inaktiviert wurde
- Knock-In-Experimente führen ein neues Gen an bestimmten Locus ein
- Analyse der Folgen geben Rückschlüsse auf Funktion des Gens
7
Q
Leistungsverbesserung bei Nutztieren
A
- erstes transgenes Schwein mit Metallothionein-(MT)-Promotor und bGH (bovine Wachstumshormon) durch Pursel et al. (1990)
- positiv: 11-14% mehr Gewicht, 4-20% weniger Fett
- negativ: schlechte Fruchtbarkeit, Gelenkprobleme, Gastritis, Pneumonie, Dermatitis, Nephritis, Hohe Mortalitätsrate
- erstes Transgenes Rind durch Bowen et al. (1994), enorme Muskelhypertrophie, gefolgt von Muskeldegeneration
8
Q
Beobachtungen bei transgenen Forellen
A
- bei domestizierten Forellen transgen größerer Effekt als beim Wildtyp
- transgener Wildtyp wuchs nicht stärker als domestizierter
- exogenes Wachstumshormon hatte ähnlichen Effekt wie Transgen
9
Q
Herstellung therapeutisch wirksamer Proteine/Peptide (Bioreaktor)
A
- Gene Pharming: Bulle “Hermann” (Niederlande 1990-2003)
- Lactoferrin-Gen (Eisenversorgung für Immunsystem)
- 80.000 Eizellen aus Schlachtovarien (28 Mio. Mark)
- einige 100 Trächtigkeiten, 5 transgene Kälber, davon 1 Bulle
- Aus Besamungen 55 Kälber, davon 23 transgen
- Sollen bis zu 10g Laktoferrin/kg Milch erzeugen
10
Q
Gentherapie für Mensch und Tier
A
- Modulierung des Immunsystems
- Transfer von spezifischen Krankheitsresistenz-Genen
- Expression von Immunoglobin-Genen
- Intrazelluläre Immunisierung (Expression eines Gens gegen Viren)
- gezielte Zerstörung von Genen, die Krankheiten hervorrufen
- somatischer Gentransfer bei Defekten
11
Q
Tiere als Organspender
A
= Xenotransplantation
- Versuche an Schweinen mit humanen Immungenen
- große Diskussionen: Stellung des Menschen, Tierrechte
12
Q
Aktuelle Beispiele aus der Tierzucht
A
- Zygoten-Injektion von TALEN modifizierter mRNA des Myostatins (MSTN) bei Rind, Schaf, Schwein
- Hornlosigkeit durch Einführung des POLLED Allels in Kühe durch somatischen Zellkerntransfer von modifizierten embryonalen Fibroblasten mittels TALEN
13
Q
Schaffung “makelloser” Elitetiere - Vision 2050
A
- bei Leistungsträgern mit sehr hohem Zuchtwert Korrektur der Erbfehler durch Ersatz der Wildtypallele
- dazu Gen-Editierung mit CRISPR/Cas9 in befruchtete Eizellen
- schnell, einfach, für alle Tierarten
14
Q
Strategie zur Etablierung
A
- Entwicklung und Konstruktion des konkreten Scheren-Systems (Erkennungssequenz)
- Einbringen in embryonale Stammzellen (ES) und Überprüfung
- Vermehrung der positiven ES-Linie
- Übertragung positive selektierte ES in Blastozyste (Maus)
- Entstehung von Chimären, Suche nach denjenigen, die Gameten mit Mutation ausbilden
- Vermehrung der GMOs
15
Q
GMO - Chancen und Risiken: beim klassischen Gentransfer
A
- erstmals Möglichkeit, neue Gene bzw. Allelvarianten in eine Art zu bringen
=> aber: - Integrationsort ist zufällig (mögliche Insertionsmutationen)
- Expression vom Integrationsort (Positionseffekt) und Anzahl der integrierten Kopien abhängig
- bekannten Leistungsmerkmale sind polygen
- Zerstörung der Homöostase, unkontrollierte Auswirkungen auf die Tiergesundheit
- sehr hohe Erstellungskosten
16
Q
GMO - Chancen und Risiken: beim Gene Pharming (Euter als Bioreaktor)
A
- einfache, schnelle und relativ preisgünstige Produktion großer Mengen von aktiven Eiweißen, ist high-quality/low-cost Verfahren für Gewinnung therpeutischer, humaner Wirkstoffe
- Prozess aber auch für komplexe Eiweiße möglich
- Gene Pharming-Reaktoren füttern und reproduzieren sich selbst
=> aber: - Expression kann Auswirkungen auf Tiergesundheit haben
- es werden enorm viele Embryonen benötigt
- Pharmaka kann mit Spuren von Milchprotein “verunreinigt” (Allergieprobleme) oder mit Tierpathogenen kontaminiert sein
- Tierwürde und Tierschutz (restriktive Haltung) sind zu beachten
- Gewinnung über Pflanzen immer stärker beachtet
17
Q
GMO - Chancen und Risiken: beim Genome Editing
A
- Erstellungszeit komplex veränderter Genome von mehreren Jahren auf Wochen reduziert
- enorm höhere Sicherheit (zumindest für Zukunft): keine “falschen” oder “zu viele” Einbaustellen
- Für die Leistungssteigerung: echtes Brechen der bisherigen Wirkungsgrenzen und Etablierung neuer Stoffwechselwege
=> ABER: - Genveränderung kaum von natürlichen Mutationen zu unterscheiden
- sind nach Gentechnikgesetz und jüngsten Entscheidungen gentechnisch modifizierte Tiere
18
Q
Klonen von Nutztieren: Erstes deutsches Klonrind “Uschi” 1998 an der LMU
A
- japanischer Stammbulle (Kamitakafuku)
- 17jährig geklont, 6 Lebendgeburten, 4 aufgewachsen
- von einem Klon erneute Klone, 2 Lebendgeburten, 1 Kalb starb kurz darauf an Anämie
- derzeitig einige 10.000 Klonrinder
19
Q
Klonen von Nutztieren: Einige 100 Klonpferde, erste war Prometea (2003)
A
- “Paris-Texas” (2005) von “Quidam de Revel” (Springpferdevererber)
- Klon von “Pieraz” (2005) Araberwallach (Distanzweltmeister)
- “E.T. Cryozootech-Stallion” (2006) von “E.T.” (erfolgreiches Springpferd)
- vier Klone von “Ratina Z” Weltmeisterin/Olympiasiegerin im Springen
- Zwei Klone von “Poetin” Weltmeisterin in Dressur
20
Q
Klonen von Nutztieren: Führende Unternehmen
A
- ViaGen (USA): genetische Sicherung: 1.600 US D, Klone: Katze 25.000 USD, Hund 50.000 USD, Pferd 85.000 USD
- Minitube (USA)
- AG Research (Neuseeland)
- Cryozootech (Frankreich): Klon eines Spitzenpferdes 230.000€
21
Q
Bedeutung des Klonens
A
- Ernährung
- Vermehrung von vom Aussterben bedrohten Rassen und sogar Spezies
- Klonen von genetisch wertvollen Tieren
- Klonen von liebgewonnenen Haustieren
- In D keine Lizenz zum Klonen, daher Kooperation bei kommerziellen Produkten (z.B. Eberhautzellen aus Bayern an Minitube (USA)
- DGfZ: Mittel- bis langfristig ist Klonen ein wichtiges Instrument, das die vorhandenen Züchtungstechnologien sinnvoll ergänzen kann
- Klone nicht in allen Züchtungsverbänden zugelassen
- seit 2012 sind Klone im Reitsport zugelassen
22
Q
Bedeutung des Klonens: Ernährung
A
- Food & Drug Administration (USA) hält Verzehr von Klonprodukten für unbedenklich
- Europäische Lebensmittelbehörde: unbedenklich, sieht aber noch Wissenslücken
- Aber Klonen für Nahrungsmittelversorgung nicht zu rechtfertigen
23
Q
Bedeutung des Klonens: Vermehrung von vom Aussterben bedrohter Rassen oder sogar Spezies
A
- Banteng auf Rindergrundlage
- Subantarktische Rinderrasse Enderby: nur noch ein lebendes Exemplar
24
Q
Bedeutung des Klonens: Klonen von genetisch wertvollen Tieren
A
- Identische Zuchttiere ohne Rekombination (robust, langlebig, leistungsfähig, schön)
- Sperma eines Top-Bullen: Einnahme von 1 Mio USD/Jahr
- GMO-Tiere dadurch schnell zu vermehren, Gene-Pharming, Krankheitsmodelltiere für Medikamententests (Diabetes, Mukoviszidose), Modelle für therapeutisches Klonen
- Verstorbene oder kastrierte Tiere später für Zucht
- Klonen von Siegerpferden für Reitsport
25
Klassische GMOs
- Herstellung rekombinanter Fremd-DNA
- Verfahren zur Erzeugung von GMOs unterliegen den Gesetzen der Gentechnik, 1990 erstes Gentechnik-Gesetz
- Voraussetzung: Erstellung der Fremd-DNA
- Klassische Gentechnik-Methoden der GMO-Erstellung (Einbringen von Fremd-DNA)
26
Herstellung rekombinanter Fremd-DNA (klassisch)
- DNA (Fragment, Gen) wird mit Restriktionsenzym aus gDNA oder auch cDNA isoliert, heute zunehmend direkt in vitro
- Vektor (Transporter, oft Plasmid) wird mit Enzym geöffnet und Fragment mittels DNA-Ligase insertiert
- Einschleusung des Vektors in Wirtszelle und Vermehrung der DNA
27
Klassische Gentechnik-Methoden der GMO-Erstellung
= Einbringen von Fremd-DNA
- Mikroinjektion rekombinierter DNA in Vorkern
- Infektion mit Viren (Transduktion)
- Transfer in Zelllinien
28
Methoden des Keimbahntransfers bei der Maus
- Mikroinjektion in Vorkern
- Injektion mit Viren
- Transfer in Zelllinien
- Kerntransfer bei Maus und Nutztieren
- Aber Blastozystentransfer bisher nur ES der Maus
29
Genome Editing
- Moderne Methoden der GMO-Erstellung sind gerichtete Modifikationen
- Diskussion, ob entstehende Organismen wirklich transgen sind
- Genom-Editing Verfahren (Nutzung genomischer Scheren)
30
Genom-Editing Verfahren (Nutzung genomischer Scheren)
- CRISPR/Cas9-System
- TALEN (Transcription activator like effector nuclease)
- ZFNs (Zinkfinger-Nukleasen)
=> Erzeugung von gezielten Mutationen
31
CRISPR/Cas9-System
- CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) und Cas9 (Spezifische Endonuclease)
- Methode basiert auf adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus
- System schneidet DNA an Stelle, die durch sgRNA (synthetische Zielsucher-DNA) vorbestimmt wird
=> dann Reparatur als:
- nicht homologes Zusammenfügen (no-homologous end joining, NHEJ), einfaches Verkleben der Enden mit Basenausfall, zerstört meist Genfunktion
- Korrekte Wiederherstellung des Stranges (homology-directed repair, HDR), dabei Schwesterchromatid als Vorlage, wenn neue Matrize geliefert wird, dient diese als Vorlage (damit Mutationssetzung möglich)
32
Nutzung CRISPR/Cas9-System
- Gentherapie, Entfernung von Krankheitserregergenomen (z.B. Hepatitis B-Virus)
- Genveränderung zur Untersuchung von Onkogenen und Tumorentstehung
- Korrektur von Mutationen in Stammzellen
- Gezielte Veränderung der Resistenz von Bakterien für Industrie (Milch- und Weinindustrie)
- Entwicklung Organismen mit fast "natürlichen", aber gezielt eingebauten Mutationen
33
Klonen
Erzeugung genetisch identischer Individuen, ist eine asexuelle Vermehrung
34
Klonen in der Natur
Tritt in der Natur:
- Regelmäßig bei niedrigen Organismen und bei Pflanzen (Knospung, Sprossung) auf
- Stellt bei Tieren die Ausnahme (eineiige, monozygote Zwillinge) dar
- beim Rind 1-5% Zwillingsgeburten, davon 20-40% monozygot
- künstliche Erzeugung genetisch identischer Individuen heute für alle Organismen möglich
35
Embryodurchschnürung
- Spermann 1901 beim Molch
- einfachste Variante
- in frühen Entwicklungsstadien, mit einem Haar
- normale Weiterentwicklung zu identischen Individuen
36
Splitten von Säugerembryonen
- Ähnlich wie bei Amphibien bzw. bei der Entstehung monozygoter Zwillinge
- nur in früher Embryonalphase (Morula, frühe Blastozyste) möglich
- Teilung innerhalb der Zona pellucida mit scharfer Klinge
37
Kerntransfer mit totipotenten Blastomeren
- In früher Embryonalphase (Morula, frühe Blastozyste)
- Gewinnung der einzelnen Blastomeren
- Einsetzen der Blastomeren in entkernte Eizellen
- Kultivierung für 6-7d
- Embryonentransfer in Empfängertier
38
Kerntransfer mit somatischen Zellen (Frosch)
- Versuch beim Krallenfrosch
- erste Demonstration der Aktivierung von Totiopotenz somatischer Zellkerne
- diploide Kerne aus Darmzellen von Kaulquappen in unbefruchtete Eizellen, deren Genom mit UV-Strahlung vorher zerstört
- Einige wuchsen zu Fröschen
39
Kerntransfer mit somatischen Zellen (Schaf)
- Dolly wurde aus Körperzellen (6-jähriges Schaf, Euterzellen) geklont
- Exakte Kopie des Schafes von dem die Euterzelle stammte
- Besonderheit: Möglichkeit von drei "Mütter" genetische, mtDNA-Spenderin durch Eizelle, Leihmutter zum Austragen (besonders bei männlichen Tieren)
40
Probleme beim Klonen
- Klon ist keine perfekte Kopie des Originals
- Veränderte epigenetische Effekte (Imprinting)
- Effizienz des Klonens ist noch gering
- gehäuftes Auftreten von Erkrankungen
41
Probleme beim Klonen: Klon ist keine perfekte Kopie des Originals
- auch Zwillinge nicht zu 100% identisch
- künstliche Klone haben drei "Mütter": Klon-Original (Zellkern), mtDNA-Spender (Herkunft Eizelle), Leihmutter (Tier mit Trächtigkeit)
42
Probleme beim Klonen: Veränderte epigenetische Effekte (Imprinting)
- während der Oogenese/Spermiogenese werden "Imprints" (imprinting control regions = ICRs) gesetzt
- genetische Imprints bleiben in Oogenese erhalten durch DNA-Methylierung, Veränderung der Chromatinstruktur durch Histon-Methylierung bzw. -Deacetylierung
- Kontrollieren durch ihre Blockade die Genexpression
- Imprints sind oft Geschlechtsspezifisch
- Folge: Allele werden entsprechend ihrer Herkunft (maternal oder paternal) unterschiedlich exprimiert
- Beispiel: Maulesel und Maultier
43
Probleme beim Klonen: geringe Effizienz
- Dolly, 277 rekonstruierte Embryos, 29 transferiert, 1 Lamm lebend geboren (0,36%)
- Rinderbeispiel: 276 rekonstruierte Embryos, 28 transferiert, 4 Kälber (1,45%)
- Pferd (Prometea): 841 rekonstruierte Embryos, 17 transferiert, 1 Fohlen, 0,12%
- Erstellung des Rusty-Klons (Pferd) erst nach 8 Jahren, bei Calvaro (Pferd) erst nach 5 Jahren
44
Probleme beim Klonen: gehäuftes Auftreten von Erkrankungen
- Plazentaveränderungen
- Aborte infolge von Imprinting-Störungen
- Organveränderung (hier bei Kälbern)
- häufig früher Tod bzw. Einschläfern von der Tiere infolge schwerer, nicht heilbarer Erkrankungen:
- Dolly nur 6 Jahre alt (Arthritis und Fettleibigkeit)
- Erster Calvaro-Klon nur 3 Wochen alt
- Beim Bateng-Versuch hab es zwei Kälber, eines war doppelt so schwer, hatte deutliche Deformationen, wurde nach wenigen Tagen eingeschläfert
45
DNA Marker
- Locus, der sich selbst und die benachbarte Chromosomenregion durch verschiedene Allele charakterisiert
- Ist polymorph (mindestens zwei Varianten), sollte geringe Mutationsrate besitzen und leicht nachweisbar sein
- Informationsgehalt ist abhängig von: Markertyp, Anzahl der Allele, Allelfrequenz
46
Direkter Marker
- Kenntnis des Gens, funktionelle Beziehung
- Kandidatengensatz
- Polymorphismus ist kausal
- Anwendung: Gendiagnose
47
Indirekter Marker
- Kenntnis der Position, örtliche Beziehung zum Merkmal
- Kopplungs- und Assoziationsanalyse
- Anwendung: Indirekter Gentest, marker-gestützte Selektion, Genidentifikation
48
Kopplungsanalyse
- Auftreten von Rekombinationen in speziellen Zuchtpopulationen wird genutzt (viele Tiere)
- Kopplungsgruppen werden statistisch analysiert: Väter, Söhne, Enkellinnen
49
Genomweite Assoziationsstudie - GWAS
- wird in zufälligen Populationen durchgeführt, Phänotypen der Tiere müssen bekannt sein
- nutzt sehr viele SNPs, die gleichmäßig über Genom verteilt sind
- zeigt, welche SNPs im Kopplungsgleichgewicht mit Genen stehen, einen Merkmalseffekt haben
50
Zucht zur Selektion
- Auswahl der Besten gegen die Schlechtesten und Verpaarung der Besten untereinander
- Dabei Berücksichtigung: Möglichst viele Merkmale gleichzeitig; Beachtung, dass Merkmale meist polygen sind; Ausschluss von Defektallelen
- Voraussetzung: Kenntnis der ursächlichen DNA-Ort oder zumindest benachbarter SNPs; Berücksichtigung dieser Information in Zuchtprogrammen
51
Nutzung Geninformation beim Rind: Zuchtziel Deutsche Holstein
- wirtschaftliche Leistungskuh mit milchbetontem Typ
- Hohe Milchleistung und entsprechendes Leistungspotential
- Großes Futteraufnahmevermögen, stabile Gesundheit, gute Fruchtbarkeit
- Genetisches Leistungspotential: 10.000kg Milch, 4% Fett, 3,5% Eiweiß
- Lebensleistung > 40.000kg Milch
- Kreuzhöhe: 145-156cm, Gewicht 650-750kg
- Korrektes und widerstandsfähiges Fundament
- Gesundes und gut melkbares Euter, erfüllt Ansprüche der modernen Melksysteme
=> leistungsstark, gesund und langlebig
52
Nutzung Geninformation beim Rind: Zusammenhang zwischen Marker und Merkmal finden
- Phänotypische Erfassung der Leistungsmerkmale
- Nutzung der kausalen Kenntnisse (Prüfung ob direkter oder indirekter Marker) zur Genotypisierung aller Tiere für einen Marker
- Genotyp und Phänotyp mittels Kopplungs- und Assoziationsanalyse vergleichen
=> Welcher Marker hat einen Effekt auf das Merkmal?
=> Welches Allel hat eine positive Ausrichtung?
53
Nutzung Geninformation beim Rind: Einige Marker gut bekannt und analysiert (DGAT1-Gen)
- DGAT-1: Diacylglycerol acyltransferase 1-Gen
- wichtig für Triglycerinbildung, KO-Mäuse ohne Milch
- Beim Rind auf BTA14, missens-Mutation: Lys>Ala
- ZW der Bullen für Berechnung genutzt
- aber DGAT1 nur ein Gen, Merkmale sind polygen
- Arbeiten an Auffindung neuer Gene/Marker (FG Brockmann)
54
Arbeiten an Auffindung neuer Gene/Marker (FG Brockmann)
- Genotypisierung der Kühe für interessante SNPs dieser Gene mit KASP-Verfahren zur Einzeltypisierung
- Genotypisierung der Bullen mit Ilumina Bovine SNP50 Bead Chip
- Bestimmung der Genotypeffekte (Leptin; korrigiert für Effekte der Herde, Kalbesaison, Kabejahr und Interaktion zwischen diesen Faktoren; Additiver Effekt der B-Variante: Erhöhung des Fettgehalts + 3,5kg)
55
Genomweite Assoziationsstudie - GWAS
- GWAS mit 20.000 Bullen zeigt, welche SNPs im Kopplungsgleichgewicht stehen, die einen Merkmalseffekt haben
- dieser Effekt kann als SNPs geschätzt werden
56
Informationen in Selektionsprogramme einbauen
- bisher in der Rinderzucht: Jungbullen an 300 Kühe zum Testen ihrer Vererbungsleistungen gepaart und daraus ZW berechnet; Bullenmütter in Prüfstation getestet
- Jetzt mit genomweiten Markerinformationen zur: Vorselektion der Jungbullen, Markergestützten Auswahl von Bullenmüttern, genomischen ZW-Schätzung
- Nutzung kausaler Kenntnisse: Nachweis von Anlageträgern (Erbfehler) mit direkten Gentest
- Nutzung von direkten und/oder QTL-Markern
57
Nutzung von direkten und/oder QTL-Markern: Marker gestützte Selektion
Auswahl von besten Zuchttieren innerhalb der Population (Rasse) durch de Kenntnisse der Allelkonstellation und deren Effekt => genomische Selektion (GS)
58
Nutzung von direkten und/oder QTL-Markern: Marker gestützte Einkreuzung
Integration von Zuchttieren aus anderen Populationen mit genetisch nachgewiesenen besonderen Allelen
59
Ziel genomische Selektion(GS)
Anreicherung von Marker- und/oder Genvarianten mit positiven Leistungseffekten
- für genomische ZW-Schätzung werden alle SNP-Effekte genutzt, auch sehr kleine
- der ZW ist letztendlich die Summe aller Durchschnittseffekte seiner Allele
- genomische Selektion = Schätzung genomischer ZW + Nutzung in Zuchtprogrammen
60
Vorteil genomische Selektion(GS)
genetische Information kann unabhängig von Alter, Geschlecht, Umwelt, Merkmal erhaben bleiben
- Erhöhung Selektionsintensität
- Aufwendige Prüfungen und Wartezeiten entfallen
- Verkürzung des Generationsintervalls (auch ohne eigene Leistung)
- Erhöhung der Selektionsgenauigkeit, Leistungsbeurteilung anhand des Genotyps und ohne Umwelteinfluss
- Nachweis von Allelvarianten mit Einfluss auf geringe erbliche Merkmale
- Bessere Kontrolle der genetischen Verwandtschaft
- stärkerer Ausschluss von negativen Allelvarianten (Erbfehlertests)
61
Probleme genomische Selektion(GS)
- Bei Selektion auf positive Phänotypen besteht Risiko des Verlusts anderer positiver, aber nicht berücksichtigt/nicht bekannter Genvarianten (z.B. reproduktive Fitness)
- negative Assoziation zwischen positiven Varianten und anderen Merkmalen sind möglich und lassen sich auch mit GS nicht ändern
- Marker-Haplotypen gelten nur in der Population und Umwelt, in der sie bestimmt wurden
- Verlust von Markerinformationen infolge einer Rekombination zwischen Marker und Merkmal ist in jeder Generation möglich
- Epistatische Effekte können derzeit noch nicht berücksichtigt werden
