Modelli di malattia

Question 1

Quali sono le modalità più comuni di manipolazione genica e in cosa consistono?

Answer 1

• Insertion: inseriamo gene per creare knock-in. Si può usare un transgene o un allele modificato
• Knockout: di un particolare gene o pezzo di DNA viene spento per valutare l’effetto dell’essenza gene in quella patologia.
• Conditional Mutant: un knockout spazialmente e temporalmente specifico.
  Esempio: tessuto-specifico
• Knock-in umanizzato: inseriamo un gene umano e andrà a codificare per proteine come è presente nell’uomo.

Question 2

Come posso ottenere dei topi transgenici?

Answer 2

Cominciamo a lavorare con cellule staminali embrionali, le poniamo in coltura e possiamo andare a creare delle modifiche (knock-in / knock-out).
Dopo di che, inietto un embrione alle prime fasi nell’utero di un topo gravido e si aspetta il tempo di gravidanza (20 giorni).
Si generano i cuccioli: 6 chimerici e 6 WT.
Dopo di che, incrocio chimerico con WT e ottengo gli eterozigoti.
Incrociano due animali eterozigoti e trovo WT, mutato ed in eterozigosi.

Question 3

Con quali metodi posso inserire del DNA nelle cellule ?

Answer 3

1. Microiniezioni di DNA esogeno clonato nel pronucleo di cellule uovo fecondate.
2. Incubazione per trasfezione: le cellule staminali embrionali vengono immerse in vitro in soluzioni che gli fanno assorbire il DNA.
   Applico trasfezione e dopo inserisco nella cavità di una blastocisti. Effettuo l’impianto e avrò generazione chimerica.
3. Elettroporazione: un impulso ad alta tensione crea dei pori nella membrana cellulare “spinge” il DNA all’interno. Successivamente la cellula è in grado di chiudere questi pori, se non riesce muore.
   È altamente efficiente per l’introduzione di geni nelle cellule di coltura tissutale di mammiferi.
4. Vettori retrovirali: sfruttiamo la capacità dei virus retrovirali di inserire il loro genoma all’interno del genoma di un ospite.

Question 4

In cosa consiste la ricombinazione omologa?

Answer 4

posso usare enzimi di restrizione per ottenere il mio DNA di interesse, poi mediante il processo di ricombinazione omologa, il gene mutato può essere scambiato con quello wt.

Question 5

Cosa sono i topi umanizzati?

Answer 5

topi che consentono ai patogeni umani specifici di infettarsi e replicarsi al loro interno e sono in grado di sviluppare risposte immunitarie funzionali specifiche per l’uomo a una serie di malattie.