Méthodes et techniques Flashcards
méthodes analytiques
quelle propriété utilisée pour: spectrophotométrie
propriété d’absorption de la lumière
méthodes analytiques
quelle propriété utilisée pour: spectrométrie d’absorption atomique?
absorption d’ondes
méthodes analytiques
quelle propriété utilisée pour: spectrométrie de masse
rapport masse / charge
méthodes analytiques
quelle propriété utilisée pour: enzymologie?
spécificité substrat vis à vis des enzymes
méthodes analytiques
quelle propriété utilisée pour: immunodosage
propriété de reco ag ac
les méthodes analytiques sont toujours précédée par une méthode séparative
vrai/faux
faux, précédée ou non
méthodes séparative
quelle propriété physicochimique exploitée par: centrifugation
densité & forme
méthodes séparative
quelle propriété physicochimique exploitée par: extraction
hydrophobicité / hydrophilicité
méthodes séparative
quelle propriété physicochimique exploitée par: méthodes chromatographiques
- hydrophobicité/hydrophilicité
- adsorption
- volatilité
- taille
- charge
- affinité
méthodes séparative
quelle propriété physicochimique exploitée par: électrophorèses
charge / forme / pm
la centrifugation permet de ?
séparer des constituants de taille et de masse variable
principe de la séparation par centrifugation?
applique force centrifuge en faisant tourner l’échantillon = accélère le phénomène de sédimentation = les molécules sont entrainées vers le fond du tube ou remontent à la surface
sur une centrifugeuse on règle..?
- temps de centrifugation
- vitesse (rpm)
- température : évite échauffement due à la rotation
coefficient de sédimentation?
exprimé en svedberg qui correspond à 10-13s (vitesse/accélération): il est mesuré expérimentalement
IL N’EST PAS ADDITIF
Une particule donnée a une vitesse spécifique de sédimentation qui
dépend de …
sa masse, volume, taille et forme (forces de frottement liées au déplacement)
mais également densité du solvant
extraction, permet de? quels types?
enrichir la solution en molécule recherchée
- liquide liquide : 2 phases non miscibles
- sur phase solide (colonne c18; silices)
méthodes chromatographiques: principe?
une phase stationnaire + phase mobile
interaction différentes entre les molécules à séparer et les 2 phases
- les molécules ont des affinités pour la phase stationnaire, plus elles sont retardées
- les molécules ont des affinités pour la phase mobile, plus elles sont éluées vite
chromatographie: affinité en fonction de plusieurs critères:
- hydrophobes hydrophiles: ?
- propriétés ioniques?
- encombrement et taille?
- interaction spécifique avec un ligand?
- hydrophobes hydrophiles: chromatographie sur couche mince / HPLC / CPG…
- propriétés ioniques: chromatographie échangeuse d’ions
- encombrement et taille: chromato d’exlusion
- interaction spécifique avec un ligand: chromato d’affinité
HPLC:
- phase stationnaire?
- phase mobile?
les molécules sont séparées en fonction de ?
détecteur associé?
- phase stationnaire: colonne remplie de particules de faible diamètre (5µm) hydrophile ou hydrophobe
- phase mobile: liquide (hydrophobe ou hydrophile)
séparée en fonction de leur polarité
détecteur: spectrophotomètre; électrochimie, fluorimètre ou spectro de masse
HPLC: avantages?
très grande sensibilité (ng), grand pouvoir séparateur ++ reproductible
petites quantités de matériel biologiques : µg
assez rapide: min à h
CPG:
- phase stationnaire: ?
- phase mobile: ?
- molécules séparées en fonction de?
- préparation de l’échantillon?
- détecteurs?
- phase stationnaire: solide ou liquide visqueux non volatil fixé sur un support inerte (colonne)
- phase mobile: gaz inerte (azote, hélium)
- molécules séparées en fonction de volatilité et polarité
- préparation de l’échantillon: injectés et vaporisés en haut de la colonne à t° élevé
-
détecteurs: ionisation de flamme ou spectro de masse…
*
-
détecteurs: ionisation de flamme ou spectro de masse…
CPG: avantages/inconvénients?
sensibles (ng), rapide (qq min à H), précise
MAIS composés à séparer doivent être volatils à température du chromatographe sinon doivent etre transformé en composés volatils stables
acide gras: non volatils même à t élevée
chromato d’exclusion = tamisage moléculaire, gel filtration
- phase stationnaire?
- phase mobile?
- molécules séparées en fonction de ?
- phase stationnaire: solide (gel) poreux
- phase mobile: liquide
- molécules séparées en fonction de : leur taille
chromatographie d’affinité
- phase stationnaire?
- phase mobile?
- molécules sont séparées par affinité = intéractions spé entre 2 molécules
- phase stationnaire: support inerte sur lequel est branché un effecteur qui présente affinité biologique avec un soluté de l’échantillon
- phase mobile: liquide
l’un des deux membres du couple est fixe et retient le 2e a partir d’un mélange
électrophorèse: principe?
technique de séparation de molécules chargées par passage à travers une matrice (maillage) sous l’effet d’un courant électrique continu
séparat° f( taille de la forme et de la charge)
UNIQUEMENT POUR MOLECULES HYDROPHILES (PAS LES LIPIDES)
électrophorèse en cdt° non dénaturantes: séparation des molécules dans leur état natif en fonction de?
- leur charge (acides nucléiques toujours - / prot et AA + ou -)
- masse moléculaire (choix du support)
- forme (molécules glboulaire +rapide)
isoélectrofocalisation?
- variante de l’electrophorese non denaturante
- ph du gel varie selon un gradient entre 2 électrodes
- fur et à mesure de sa migration dans le gel, molécule soumise à un ph différent
- qd atteint phi, neutre, arrêt de la migration
électroph en condition dénaturantes:
- on dénature préalablement les protéines=…?
- agents dénaturants?
- dissociation structures 3aire et 4aire des protéines (disso dimères, perte forme globale, hélices alpha souvent conservées
- agents dénaturants: SDS (sodium dodécyl sulfate), urée, B-mercaptoéthanol (coupe SS)
SDS PAGE
- électro en cdt dénaturante
- extrait prot traités par sds: se fixe sur les prot, donnent charges négatives et forme de batonnet
- prot ne migrent que en fonction de leur poids moléculaire
