Méthodes et analyse moléculaire Flashcards
Quelles sont la méthodologie pour l’étude de l’ADN
- Isoler l’ADN d’un tissu
- Identifier ou isoler des régions d’ADN homologues
- Détecter la variation au niveau de ces régions
Quelles sont certaines utilisations de l’identification de l’ADN homologue régional
Transfer de type Southern
PCR
Clonage
Quelles sont les sondes
Molécule d’ADN marquée (32P, biotine, éléments fluorescents). Utile pour l’identification d’une cible (généralement un gène/locus donne)
C’est quoi le transfer de type Southern
ADN fragmenté puis séparé un gel. ADN ensuite transféré vers une membrane de nitrocellulose (ou nylon). Ajout de la sonde à l’ADN fixe à la membrane pour hybridation
Quelle était l’hypothèse du transfer de type Southern
Les régions qui s’hybrident avec la sonde lui sont homologues
Qu’est-ce que la PCR
Réaction de polymérisation en chaîne. Répétition de cycles de dénaturation, d’hybridation des amorces (annealing) et d’élongation. Il est utilisé pour faire plusieurs copies d’un segment d’ADN d’intérêt, générant un grand nombre de copies à partir d’un petit échantillon initial
Quel est le but de l’amplification de l’ADN
L’amplification des segments d’ADN permet la détection de virus ou de bactéries pathogènes, l’identification d’individus (empreinte ADN) et plusieurs recherches scientifiques impliquant la manipulation de l’ADN
Quelles sont toutes les parties nécessaires de la PCR
Il a lieu dans un thermocycleur (il effectue les cycles de température). Nous mettrons notre ADN cible, les amorces, les nucléotides et la polymérase dans un tube puis le placerons dans le thermocycleur.
Quelle est la première étape du premier cycle de PCR
Au cours du premier cycle, il y aura une dénaturation à 95 degrés Celsius qui sépare les brins d’ADN.
Quelle est la deuxième étape du premier cycle de PCR
Au cours du premier cycle, la deuxième étape est qu’il y a ensuite un processus de recuit (annealing) qui se produit entre 55 et 65 degrés Celsius. Les amorces se fixeront à l’ADN cible
Quelle est la troisième étape du premier cycle de PCR
Au cours du premier cycle, la dernière étape est une extension qui se produit à 72 degrés Celsius. Les polymérases se fixent sur les amorces et elles prendront ensuite les nucléotides libres dans la zone environnante pour créer un brin d’ADN complémentaire et cela se poursuit jusqu’à l’extrémité du brin d’ADN.
Que se passe-t-il dans le deuxième cycle de PCR
Le deuxième cycle suit les mêmes étapes cependant, au lieu de deux brins, ce sont maintenant quatre brins d’ADN qui sont répliqués. Les brins créés à partir de ce deuxième cycle sont plus courts que ceux du premier cycle.
Que se passe-t-il dans le troisième cycle de PCR
Le troisième cycle suit les mêmes étapes cependant, au lieu de quatre brins, ce sont maintenant huit brins d’ADN qui sont répliqués. À la fin de ce troisième cycle, nous avons maintenant obtenu la séquence d’ADN cible que nous recherchions depuis le début
Que se passe-t-il après le troisième cycle de PCR
Une fois que nous atteignons le quatrième cycle de PCR, le nombre de copies de l’ADN cible augmente de façon exponentielle. Il y a aussi des fragments d’ADN de longueur variable qui sont en cours de création et nous verrons créés mais à une quantité moindre
Quelle est l’importance de la PCR
L’ADN peut être amplifie à partir d’une seule copie. Très peu invasif : Excellent pour les petites animaux, insectes, microbes, spermatozoïdes, ovules, poils, os, salive, urine, selles, échantillons anciens. L’ADN n’a pas besoin d’être parfaites conditions : Excellent pour applications en criminologie. On peut cibler des régions spécifiques sans avoir à les cloner
Quels sont les outils du clonage
ADN d’intérêt, vecteurs cellules hôtes, banque de clones
Quels sont les techniques du clonage
Restriction, ligation, transformation et sélection
C’est quoi les plasmides
Types de vecteurs. Petite taille. Quelques kb. Réplication indépendante. Multiples copies
Quelles sont les étapes de base du clonage
Coupez l’ADN étranger et le vecteur avec Xball. Transformez les bactéries. Plaque sur ampicilline et X-Gal. Cela deviendra bleu ou blanc.
Quelles sont les façons dont nous détectons la variation de l’ADN
Électrophorèse sur gel d’agarose ou de polysaccharide. Restriction. Séquençage
Comment visualisons-nous l’ADN
Dans l’agarose, on peut utiliser du bromure d’éthidium (Bet) pour marquer tout l’ADN présent (lecture : UV). BEt utilise après migration dans les gels d’acrylamide ou d’agarose. Radioactivité peut aussi être utilisée pour les gels d’acrylamide (lecture : exposition d’un film photographique, autoradiographie)
Quelle est la restriction
Les enzymes de restriction reconnaissent et coupent des séquences spécifiques d’ADN. Certaines enzymes coupent des séquences de 4, 5, 6, 7 et 8 paires de bases. Digestion laisse des bouts collants, 5’ ou 3’ ou francs
Quelles sont les méthodes utilisées lors de la création d’une carte de restriction
Digestions simples et combinées. Digestions partielles. À partir de la séquence d’ADN connue
Qu’est que c’est les digestions partielles
Dans les digestions partielles, un site peut être coupée ou non. Ainsi toutes les combinaisons de coupures possibles sont obtenues
Qu’est que c’est une carte à partir de la séquence
À partir de la séquence de l’ADN de l’individu et de la séquence du site de restriction. Utilisation de programmes informatiques
Quelle est la méthode originale de séquençage de l’ADN
Terminaison par didésoxyribonucléotides (ddNTP) de Sanger. Les didésoxyribonucléotides (ddNTPs) places dans 4 réactions différentes. Fragments d’ADN marques par radioactivité
Qu’est-ce c’est nécessaire pour le séquençage de l’ADN?
Séparation de fragments d’ADN dont les tailles ne diffèrent que d’un nucléotide. Production de fragments qui commencent tous au même point mais se terminent à chacune des bases de la séquence. 4 différentes réactions, pour chacun des 4 types de terminateurs : A, C, G, T
Quelle est la différence entre la PCR et le séquençage d’ADN
La PCR utilise deux amorces et le séquençage de l’ADN utilise une amorce
Que sont le séquençage automatique
4 didésoxyribonucléotides (ddNTP) dans la même réaction mais marqués de différentes couleurs par fluorescence
Qu’est-ce que c’est le séquenceur de type capillaire
C’est plus rapide que le séquençage automatique
Quelles sont les conclusions sur les analyses moléculaires
Les techniques de clonage, restriction, RFLP, Southern blots ont vraiment permis une explosion de l’analyse de la génétique des populations. Ces techniques sont encore très utilisées. La PCR a été l’une des techniques les plus importantes pour l’avancement de la biologie moléculaire et des techniques basées sur la PCR ont graduellement remplaces ces techniques. La PCR est une technique de routine en génétique des populations
