IV-15 Toxoplasmose

Question 1

Agent pathogène du toxoplasmose?

Answer 1

Toxoplasma gondii

• protiste/protozoaire
• ordre des Coccidies
• embranchement/ phylum des Apicomplexa : sporozoaire
• genre Toxoplasma
• cycle hétéroxène, complexe (phase sexuée et phase asexuée)
• parasite intracellulaire obligatoire

-pénétration active dans la cellule à l’extrémité apicale : complexes d’organites spécialisés pour pénétration dans les tissus ou cellules hôtes
> rhoptrie (invasion)
> micronème (motilité, invasion et virulence)
> conoïde

-3 formes, fonction de l’hôte
> chez l’Homme : tachyzoïtes et bradyzoïte
> chez le chat : sporozoïte

Question 2

forme tachyzoïte du Toxoplasma gondii?

Answer 2

-forme végétative intracellulaire OBLIGATOIRE (pénétration active + mobilité)
-forme infectante
- dans l’hôte intermédiaire
> forme de dissémination sanguine

• parasite les cellules du système des phagocytes mononuclées
• responsable des manifestations cliniques
• réplicatives : multiplication rapide +++ dans une vacuole parasitophore
• infection phase aigue
• en croissant
• 6-8µ x 3-4µ
• extrémité antérieur effilée
• noyau central
• Type I : très virulent chez la souris
• Type II : non virulent chez la souris
• Type III : virulence intermédiaire
• Recombinant : virulence variable

Question 3

Forme bradyzoïte, kyste, du Toxoplasma gondii?

Answer 3

Transformation du tachyzoïte (pH, températures élevés, en réponse à l’activation du système immunitaire)

Forme végétative intracellulaire/ hôte intermédiaire
> forme de résistance intracellulaire quiescente (persiste toute la vie!)
> kyste inaccessible à l’immunité et aux traitements
> Réplication lente +++ (conduisant au développement de vacuole parasitophore sans rupture cellulaire)
> persistance du noyau de la cellule hôte, progressivement éliminé, importance d’un dépot intrakystique constituant la paroi kyste

phrase chronique

Noyau postérieur
Grains d’amylopectine

• entourés d’une paroi épaisse (membrane de la cellule hôte + celle de la vacuole parasitophore)
• métabolisme ralenti
• regroupés au sein de kystes (centaines ou milliers) inaccessibles à l’immunité
• concentrés dans les neurones, les astrocytes, les cellules rétiniennes et musculaires

Question 4

Sporozoïte/oocyste de Toxoplasma gondii ?

Answer 4

• forme infestante issue de la reproduction sexuée
• forme de dissémination environnementale
• très résistant

-chez l’hôte définitif (chat)
> production intestinale, excrétion fécale

-chez l’hôte intermédiaire
> ingestion alimentaire, transformation sporozoïtes en tachyzoïtes

-dans l’environnement :
> la sporulation donne des sporozoïtes qui seront disséminés

• noyau postérieur
• Peu différent des autres formes
• dans un oocyste : 2 sporocystes contenant chacun 4 sporozoïtes

Question 5

Hôtes du Toxoplasma gondii ?

Answer 5

• hôte définitif : chat - hébergent le cycle complet (sexué et asexué) du parasite
• hôtes intermédiaires : oiseaux, mammifères (mouton, boeuf et Homme) - que cycle asexué
• hôtes intermédiaires et définitif se contaminent par voie digestive

Question 6

Infection au Toxoplasma gondii ?

Answer 6

HOTE DEFINITIF
1) infection de l’hôte définitif par des kystes
> ingestion de kystes dans les tissus d’oiseaux/mammifères dont les chats se nourrissent
> action de la pepsine : libération des bradyzoïtes contenus dans les kystes
> transformation en tachyzoïtes qui pénètrent dans les cellules intestinales
> multiplication des tachyzoïtes par reproduction dans les cellules intestinales
> nombreuses divisions cellulaires aboutissant à la formation de schizontes

• multiplication asexuée = schizogonie aboutit à un schizonte, cellule plurinuclée qui éclate à maturité et lyse l’enterocyte
  = libération des mérozoïtes. Chaque mérozoïte va alors coloniser un nouvel entérocyte.
• après qq cycles de schizogonie, début de la gamogonie (reproduction sexuée) par formation des gamontes femelles (macrogamètes) et mâles (microgamète)
  = des mérozoïtes peuvent subir une réduction chromatique et produire des gamètes mâles ou femelles.
• les gamètes mâles quittent l’entérocyte pour aller féconder un gamète femelle contenu dans un autre entérocyte.

> fécondation et formation d’oocystes immatures, non sporulés, non infectant
= formation d’un œuf qui va s’enkyster et devenir un oocyste qui sera libéré dans la lumière intestinale puis dans les selles.
= élimination dans le milieu extérieur (par les déjections), 4-5 jours après l’infection et durant 15 jours

2) infection de l’hôte définitif par des oocystes matures (sporulés)
- ingestion des oocystes sporulés et libération des sporozoÏtes qui se transforment en tachyzoïtes
- reproduction sexuée dans les cellules intestinales et élimination d’oocystes immatures

→ sporulation (si T° < 37°C et présence d’O2) avec formation de sporocystes

• chaque sporocyste contient 4 sporozoïtes formant l’oocyste mature
• les oocystes matures peuvent rester quiescents plusieurs mois avant d’infecter un autre hôte définitif ou intermédiaire

HOTE INTERMEDIAIRE
3) infection de l’hôte intermédiaire (Homme)
→ contamination par ingestion d’oocystes matures (végétaux, manque d’hygiène des mains)
PHASE D’INVASION
- libération des sporozoïtes qui se transforment en tachyzoïtes pénétrant dans les cellules intestinales, diffusant par voie sanguine et lymphatique
- multiplication dans les monocytes sanguins → parasitémie de courte durée → dissémination possible dans tous les tissus (y compris transplacentaire avec atteinte du foetus chez la femme enceinte)
- tachyzoïtes → bradyzoïtes (multiplication ralentie) sous l’influence du système immunitaire
PHASE DE LATENCE
- enkystement des bradyzoïtes dans une paroi très résistante, à l’abri du système immunitaire
- sites préférentiels (pauvres en anticorps) = muscles, cerveau, oeil

→ contamination par ingestion de kystes (viande de mouton ou boeuf mal cuite) => cycle asexué

Question 7

Epidémiologie

Answer 7

• toxoplasmose = parasitose cosmopolite.
• prévalence varie avec l’âge, les habitudes alimentaires, les conditions environnementales
• = 600 000 nouvelles infections par an en France dont 2500 femmes enceintes
• dans les pays développés, contamination essentiellement par la viande infectée

Question 8

Modes principaux de la contamination ?

Answer 8

• absorption d’oocystes (contamination indirecte par ingestion de fruits et légmes crus et mal lavés, mauvaise hygiène des mains après contact avec la terre ou les chats)
• transmission par les kystes (ingestion de viandes fumées, peu cuites, les kystes étant détruits par cuisson > 65° ou congélation à -12°C pendant au moins 3 jours : transplantation d’organes)
• transmission par les tachyzoïtes, forme fragile responsable de transmission transplacentaire dans les toxoplasmoses congénitales
• facteur de risque majeur chez une femme enceinte séronégative : repas hors du domicile (contrôle moindre du lavage des aliments)
• seuls les chats chasseurs pour se nourrir sont à risque toxoplasmique

Question 9

Parmi les moyens de défense de l’hôte // toxoplasmose

Answer 9

• immunité humorale n’a pas un rôle central dans le contrôle de l’infection
• immunité cellulaire T a un rôle majeur (LT CD8, LT CD4 et IL2)

Par conséquent,

• si déficit de l’immunité cellulaire (VIH+++- : les bradyzoïtes des kystes se changent en tachyzoïtes : destruction tissulaire (avec inflammatio,, nécrose)
• chez le foetus, non immuno-mature : gravité potenielle de la toxoplasmose congénitale

Question 10

Clinique de la toxoplasmose ?

Answer 10

• 3 grands tableaux cliniques
• toxoplasmose acquise de l’immuno-compétent
• toxoplasmose de l’immunodéprimé
• toxoplasmose congénitale

→ chez le sujet immunocompétent

• asymptomatique dans plus de 80% des cas
• sinon : fièvre, adénopathies (cervicales +++) et asthénie (parfois profonde et persistant plusieurs semaines à plusieurs mois)
• évolution bénigne et guérison spontanée (très rares formes graves chez des patients infectés par des souches guyanaises)

→ chez le sujet immuno déprimé, formes graves constamment mortelles sans traitement (sauf localisation oculaire isolée => cécité). Schématiquement, on distingue

• les formes localisées
  • cérébrales
  le plus souvent, dont le tableau est celui d’un abcès avec céphalées, fièvres, déficit neurologique focal +/- crises convulsives
  • oculaire
  avec baisse de l’acuité visuelle, “mouches volantes” et oeil rouge (en cas de VIH, souvent associée à une localisation cérébrale).
  • pulmonaire
  (tableau de pneumopathie fébrile avec dyspnée évoquant une pneumocystose
  • autres localisations (tachyzoïtes peuvent envahir tout type de cellule)
• les formes disséminées
• fièvre isolée avec altération de l’état général
• réactivation d’une toxoplasmose ancienne ou primo-infection
• réactivation possible si VIH avec CD4 < 100/mm^3, gresse de cellules souches hématopoïéttiques, syndrome lymphoprolifératifs

Question 11

Toxoplasmose congénitale : clinique ? suivi ?

Prise en charge de la mère ? du nourrisson ?

Answer 11

-contamination du foetus lors de la grossesse par primo-infection chez la mère le plus souvent (exceptionnemment par réactivation chez la femme enceinte immunodéprimée)

-le risque de transmission augmente avec le terme mais le risque de formes graves diminue avec le terme
→ Le risque de transmission est fonction de la perméabilité placentaire qui augmente avec le terme. Max vers 24 SA.

-peut être responsable d’une fausse couche spontanée

Si la grossesse arrive à terme, on différencie classiquement
> toxoplasmose congénitale grave : encéphalo-méningo-myélite
(macrocéphalie avec hydrocéphalie, calcifications intracranienne, choriorétinite pigmentaire, ou tableau d’infection néonatale généralisée grave), rare en France

> toxoplasmose congénitale retardée, se manifestant dans la petite enfance au plus tard (retard psychomoteur, hydrocéphalie, choriorétinite pigmentaire progressive, convulsions…)

> toxoplasmose congénitale latente où les nouveaux nés sont indemnes cliniquement (diagnostic uniquement biologique). Forme la plus fréquente en France = prise en charge (diagnostic uniquement biologique). Forme la plus fréquente en France => prise en charge précoce pour éviter les formes retardées neurologiques ou oculaire.

• Datation de la séroconversion par mesure de l’avidité des IgG
• Suivi échographique mensuel de la mère et traitement par Spiramycine
• Diagnostic prénatal possible à partir de la 18ème SA, en respectant un délai de 4 semaines après la date supposée de l’infection
  → se fait par amniocentèse (recueil de 10-20 mL de liquide amniotique, ne pas oublier d’informer et de recueillir le consentement de la patiente)
• Recherche de l’ADN de Toxoplasma gondii par PCR sur le liquide amniotique, si positif : traitement de la patiente par PSA (Pyriméthamine + Sulfadiazine + Acide folinique) jusqu’à l’accouchement, puis effectuer un profil comparé des Ac NN/Mère pour confirmer la toxoplasmose congénitale
• Suivi +++ de l’enfant pour complication pendant un an : examen oculaire fond d’oeil, sérologie, recherche d’ADN par PCR…

NB : La sulfadiazine est contre-indiquée pendant le premier trimestre mais peut être donnée par la suite s’il y a risque de transmission congénitale. Les sulfamides peuvent provoquer chez la femme enceinte de graves réactions d’hypersensibilité.

Question 12

Diagnostic biologique de toxoplasmose ? chez immunocompétent?

Answer 12

• repose surtout sur le sérodiagnostic
• recherche d’Ac et l’étude de leur cinétique permettent de définir le statut sérologique et le stade de l’infection

-chez l’immunocompétent : rechreche d’IgG et d’IgM =
> pour les IgG, on peut utiliser le dye test (référence, pas en routine), des méthodes ELISA, l’IFI ou l’agglutination sensibilisée. Résultats exprimés en UI/mL
> pour les IgM, la méthode de référence est l’immunocapture-agglutination = ISAGA (immuno-sorbent agglutination assay). Résultats exprimés en index.

> d’un point de vue cinétique, les IgM apparaissent en premier (dans la 1ere semaine post-infection) puis les IgG (à partir du 8-10e jours) qui s’élèvent pour atteindre un plateau (à partir du 2e mois) puis décroissent lentement jusqu’à un seuil résiduel persistant toute la vie.

=> pour affimer le caractère évolutid d’une toxoplasmose, i faut 2 sérums prélevés à 15-20 jours d’intervalle, observer soit une séroconversion, soit un doublement des titres d’IgG (e, ELISA) ou au oins deux dilutions d’écart dans les méthodes par dilution (IFI= immunofluorescence indirecte) dans le même laboratoire. ?
> les techniques actuelles (très sensibles) détectent des IgM de manière persistante : la présence de cet isotype ne permet pas d’affirmer le caractère récent d’une toxoplasmose
> la recherche d’IgA spécifiques et une étude fine des IgG (agglutination différentielle, avidité), permettent souvent de distinguer infection récente et ancienne
> dans le compte-rendu des résultats, le biologiste doit mentionner la technique, les valeurs seuils et une conclusion détaillée

Question 13

Diagnostic biologique de toxoplasmose chez l’immunodéprimé

Answer 13

-le terrain et la clinique font réaliser un bilan d’imagerie et un traitement d’épreuve (devant la gravité des tableaux neurologiques notamment). EN cas de réactivation d’une toxoplasmose ancienne, la sérologie ne permet pas d’affirmer que le tableau clinique aigu est en rapport avec la toxoplasmose et n’a qu’une valeur d’orientation.

Le diagnostic sera donc confirmé par
> efficacité du traitement d’épreuve
> mise en évidence du parasite par :

✯ DIAGNOSTIC DIRECT
EXAMEN DIRECT
- prélèvement : sang, ganglion, biopsie cérébrale
- recherche directe sur frottis => trophozoïtes intra ou extracellulaire + kystes
= visualisation directe par coloration optique (May Grunwald Giemsa)
OU sur coupe histologique : Giemsa ou hématoxyline, immunofluresence, immunoperoxydase

BIOLOGIE MOLECULAIRE : ADN parasitaire, charge parasitaire
PCR sur tout type de prélèvement (LCR, LBA, moelle osseuse…)
☞ toujours réalisé en parallèle de l’examen direct.

INNOCULATION à la souris (intra-péritonéale) : sérologie 30 jours par inoculation, examens des cerveaux, mise en évidence des kystes intracérébraux

CULTURE CELLULAIRE :
MRC5, Hela
- intérêt : isolement de la souche de toxoplasme pour typage
- réservé aux laboratoires spécialisés

✯ DIGNOSTIC INDIRECT = sérologie
- prélèvement : sérum, LCR, humeur aqueuse
- recherche d’Ac dirigé contre
• Ag de surface : “Dye test” ou test de lyse des toxoplasmose = technique de référence, IFI, réaction d’agglutination directe, ISAGA (Immuno-Sorent Agglutination Assay)
• Ag cytoplasmique solubles : HAI, agglutination de particules de latex sensibilisées, ELISA, immunocapture
→ A l’heure actuelle : techniques automatisée de détection des IgG et des IgM

Détection des IgG spécifiques

• ELISA, immunochimiluminescence
• étalonnage par rapport à un étalon de international OMS. Pas de standardisation des valeurs observées entre trousses commercialisées.

Détection des IgM spécifiques
- méthodes les plus utilisées : ELISA et ISAGA
- spécificité imparfaite pour l’ensemble des techniques
- ISAGA : le plus sensible mais spécificité faible (60%)
NB : ISAGA = Agglutination après immunocapture : la réaction ISAgA (Immuno-Sorbent Agglutination Assay) est une variante de l’agglutination directe, mais après capture des anticorps IgM, éventuellement IgA, sur phase solide sensibilisée par un anticorps anti-IgM (-IgA) humaines. En cas de positivité, les parasites sont uniformément répartis sous forme de voile tapissant le fond de la cupule réactionnelle. L’image obtenue permet d’établir un score (0 à 12)

Mesures complémentaires :
- Avidité des IgG
- IgA spécifiques : diagnostic de toxoplasmose congénitale
- profils immunologiques comparés :
→ ELIFA, WB
→ étude comparative de plusieurs échantillons appariés :
- mère/enfant : recherche d’Ac spécifiques synthétisée par l’enfant
- LCR/sérum : recherche de synthèse intrathécale d’Ac
= bandes supplémentaires sur WB ou Immunoblot

Question 14

Diagnostic biologique chez les femmes enceintes de toxoplasmose ?

Answer 14

Mesure de surveillance réglementaire de la toxoplasmose chez la femme enceinte :
→ à la déclaration de la grossesse
→ obligatoire
→ par 2 techniques différentes : sérologie IgM et IgG

• Sérologie conseillées chez toutes les femmes ayant un projet de grossesse
• Dépistage sérologique : IgG + IgM avec 2 techniques différentes si absence de document attestant l’immunité acquise.

-examens sérologiques systématiques pour dépister les femmes, dépourvues d’IgG spécifiques, exposées au risque “toxoplasmique”
> si présence d’IgG spécifiques avant la grossesse (au mieux montrée sur 2 prélèvements sanguins) : pas de surveillance ultérieure (sauf cas particuliers d’immunodépression, d’infection VIH…)
> si sérologie inconnue ou négative antérieurement : faire sérologie le plus tôt possible, en début de grossesse
↪ si sérologie négative : suivi mensuel ⚠ + 1 fois après l’accouchement pour s’assurer qu’il n’y a pas eu de séroconversion lors du dernier mois

Si IgG- et IgM- : femme non immunsée

Si IgG- mais IgM + : vraies ou fausses IgM ?

• apparition possible d’IgM non spécifiques de titre stable en fin de grossesse
• nécessite de confirmer systématiquement par une technique plus spécifique.
• Si IgM confirmées : recherche apparition IgG sur un sérum prélevé à 2 semaines pour confirmer séroconversion.

Si IgG+ et IgM- = femme immunisée
→ IgG stable infection ancienne santé-conceptionnelle
→ avidité des IgG :
- si > seuil : infection récente exclue, à confirmer sur un 2e sérum à 3 semaines
- si < seuil : infection récente non exclue : contrôle sérologie à 3 semaines
↪ taux en ↑ : infection datant de moins de 2-3 mois à la date du 1er sérum
↪ taux stable : infection datant de plus de 2-3 moins à la date du 1er sérum

Question 15

CAT en cas de sérologie initiale négative

Answer 15

• sur le 1ere prélèvement,
  > si IgM - et IgG -
  => non protégée, surveillance mensuelle jusqu’à accouchement + mesures hygiéno-diététiques
• sur le 2e prélèvement, si
  > IgM - et IgG - => non protégée, surveillance mensuelle jusqu’à accouchementt
  > IgM - et IgG + => faux positif ? primo-infection sans IgM (rare +++) ? anticorps passifs (transfusions, injection d’Ig)? Ig non détectées sur le 1ere sérum ?
  => retester les 2 prélèvement et en étudier un 3e rapidement
• IgM + et IgG + : séroconversion
• IgM + et IgG - : séroconversion probablement en cours
  => contrôles ultérieurs jusqu’à apparition des IgG parfois jusqu’à 2 mois, au-delà on retiendra l’hypothèse d’IgM non spécifiques

Question 16

Toxoplamose : Sur un 1er prélèvement, IgM - et IgG +

Answer 16

Infection anciene probable, contrôle par prudence 3 semaine après
> IgG+ avec titre stable : infection ancienne, arrêt de la surveillance
> ascension du titre d’IgG : primo-infection sans IgM (très rare) ? réactivation sérologique? pour trancher, techniques compléemntaires (avidité, agglutination différentielle) en s’aidant également de la clinqiue

Question 17

Toxoplasmose : 1er prélèvement : IgM +, IgG +

Answer 17

Contrôle 10j et/ou 3 semaine après
Prendre en compte les signes clinqiues, les résultats antérieurs s’ils existent , utiliser d’éventuels sérums conservés
> IgG avec titre stable à 10j, 3 semaines : toxoplasmose évoluant depuis au moins 2 mois avant le 1e prélèvement
=> pour une meilleure précision, techniques complémentaires (agglutination différentielle, avidité)
> ascension du titre IgG (x2) => toxoplasmose récente, acquise à priori moins de 2 mois avant le 1e prélèvement

Question 18

Toxoplasmose : 1er prélèvement : IgM + et IgG - => contrôle 10 j et/ou 3 semaines près,

Answer 18

prendre en compte les signes cliniques, les résultats antérieurs s’ils existent, utiliser d’éventuels sérums conservés
> apparition des IgG : toxoplasmose récente, acquise à priori moins de 2 mois avant le 1ere prélèvement
> absence d’IgG à 3 semaines : probables IgM non spécifiques ou toxoplasmose récente avec apparition très retardée des IgG
=> contrôle à 3 semaines

Question 19

Suspicion de toxoplasmose congénitale

Answer 19

Toute toxoplasmose acquise pendant la grossesse expose le foetus au risque d’infection par passage transplacentaire du parasite
» diagnostic anténatal in utero (mise en évidence du parasite) ou post-natal (mise en évidence du parasite +/- étude de la réponse humorale).

1° Le diagnostic anténal repose sur la mise en évidence du génome de T. gondii par PCR sur liquide amniotique.

• L’amniocentèse doit être réalisée à partir de la 18e semaine d’aménorrhée et au moins 4 semaines après la date estimée de l’infection maternelle.
• L’inoculation du liquide amniotique à la souris (résultats en 3-6 semaines) est réalisée conjointement pour pallier les rares faux négatifs de la PCR
• Ces deux techniques peuvent être complétées par la recherche du parasite en culture cellulaire lorsque le liquide amniotique est hémorragique (la présence de sang peut en effet, inhiber l’amplification PCR)

2° Le diagnostic post-natal doit être effectué lorsque l’histoire sérologique maternelle est suspecte + diagnostic anténatal négatif ou non pratiqué.

Recherche du parasite de façon indirecte (inoculation à la souris, PCR) sur le placenta et le sang de cordon (LCR plus rarement)
ET
Profil immunologique comparé mère/enfant par Western Blot ou ELIFA.

Lors de l’accouchement, des IgM et des IgA maternelles peuvent passer pa effraction placentaire dans le sang du bébé => ce n’est qu’après 2 jours et 10j de vie respectivement que leur détection dans le sang du bébé permet d’affirmer la toxoplasmose congénitale. En revanche, l’absence de ces 2 isotypes ne permet pas d’exclure le diagnostic.

Question 20

Suivi sérologique de l’enfant

Answer 20

• sérum de la mère et prélèvement de l’enfant à la naissance : J10, M1, M2, M3 pour les sérologies standards, recherche d’IgM et d’IgA sépcifiques et profil comparé des sérums
  » procédure qui diagnostique environ 95% des toxoplasmoses congéniales dans les 3 premiers mois de vie.

Sérologie à M4? M6, M9 et M12 confirment les 5% des cas restants sur la persistance d’IgG spécifiques.

DIAGNOSTIC NEONATAL
- pour tous les nouveaux nés de mère ayant fait une séroconversion toxoplasmique pendant la grossesse si diagnostic prénatal non réalisé ou négatif
→ à la naissance : fond d’oeil + échographie transfrontanellaire
→ diagnostic parasitologie direct sur le placenta : inoculation à la souris et/ou PCR
→ diagnostic sérologique : détection d’anticorps spécifiques synthétisés par le nouveau-né sur prélèvement sanguin à J3
- IgM/IgA spécifiques
- présence : confirmation du diagnostic de toxoplasmose congénitale
- absence : n’exclut pas le diagnostic de toxoplasmose congénitale
- profil comparé des IgG sériques mères/enfant

SUIVI POST-NATAL
- examen psychomoteur, fond d’oeil pendant 1 an
- surveillance sérologique : IgG, IgM +/- IgA
→ mensuelle pendant 3 mois puis tous les 2 à 3 mois pendant 1 an

• négativation IgG (d’origine maternelle) en 5-8 mois, confirmée sur un 2e prélèvement. → absence de toxoplasmose congénitale
• persistance et/ou ascension des taux d’IgG au-delà de la 1er année de vie = synthèse d’IgG par l’enfant → diagnostic de toxoplasmose congénitale

Question 21

Diagnostic de toxoplasmose oculaire

Answer 21

• ophtalmologique
• en cas de doute, ponction de la chambre antérieure pour analyser de l’humeur aqueuse (PCR, sérologie avec calcul du rapport Desmonts, profil immunologique comparé sang/humeur aqueuse…)

Question 22

Principales méthodes sérologiques

Answer 22

techniques séologiques utilisent

• soit des Ag figurés (trophozoïtes entier, vivants ou fixés)
• soit des Ag solubles (extraite de tachyzoïtes +/- purifiés)

Question 23

Techniques utilisant des antigènes figurés (corps toxoplasmiques)

Answer 23

Dye test (Sabin et Feldman)
- il est fondé sur la lyse des toxoplasmes vivants obtenus à partir du liquide péritonéal de souris infectées par les anticorps en présence de complément humain frais. La lecture se fait au microscope en contraste de phase. Longtemps considéré comme référence, ce test lourd et coûteux n’est plus pratiqué que par des laboratoires très spécialisés.

Agglutination directe (Fulton) : 
- il met en jeu l’agglutination d’une suspension de toxoplasmes inactivés par le formol par les anticorps. La technique peut être sensibilisée (ADS) par traitement préalable des toxoplasmes par la trypsine. On teste le sérum natif et après traitement par le 2-mercapto-éthanol pour avoir, d’après la différence des titres obtenus, une estimation de la présence éventuelle d’anticorps IgM. Le test est simple à réaliser et à lire, mais les résultats peuvent être approximatifs. Il est actuellement peu pratiqué.

☞ Agglutination après immunocapture :
- la réaction ISAgA (Immuno-Sorbent Agglutination Assay) est une variante de l’agglutination directe, mais après capture des anticorps IgM, éventuellement IgA, sur phase solide sensibilisée par un anticorps anti-IgM (-IgA) humaines. En cas de positivité, les parasites sont uniformément répartis sous forme de voile tapissant le fond de la cupule réactionnelle. L’image obtenue permet d’établir un score (0 à 12). Ce test est simple à réaliser, il n’est pas influencé par la présence éventuelle de facteur rhumatoïde. Il est commercialisé. Très sensible, il permet de détecter précocement la présence des IgM anti-toxoplasme, mais reste positif de nombreux mois.

☞ Immunofluorescence indirecte (IFI) :
- c’est un test classique utilisant des toxoplasmes formolés fixés sur une lame. En fonction de l’anti-immunoglobuline marquée utilisée, il permet de détecter les différents isotypes d’anticorps (test de Remington pour la détection et le titrage des IgM). Il est simple à réaliser mais la lecture nécessite un observateur entraîné. Les réactifs sont commercialisés.

Question 24

Antigènes solubles

Answer 24

Technique initiale
ELISA IgG/IgM
Hématogglutination

Technique complémentaire
ELISA IgA
Mesure de l'avidité IgG
ELIFA
Western blot

Techniques utilisant des antigènes solubles
• Agglutination passive : `
- utilise des particules de latex recouvertes d’antigène parasitaire.
- est réalisée sur une plaque de verre et la lecture se fait après quelques minutes à l’œil nu.
- est sensible mais cependant sujette au phénomène de zone (résultat faussement négatif en cas de présence d’anticorps à taux élevé) et elle ne différencie pas les différents isotypes d’anticorps.
On peut aussi utiliser des hématies de mouton recouvertes d’antigène toxoplasmique. La réaction est effectuée en plaque de microtitration et peut être quantifiée.

 •  Tests enzymo-immnulogiques (EIA) : 

• utilisent des antigènes solubles dont la nature et le mode de préparation diffèrent, ce qui peut nuire à la standardisation des résultats.
• permet de quantifier les anticorps IgG et IgM. Dans ce dernier cas, il existe des tests indirects, avec révélation par un anticorps anti-IgM humaines marqué, et des tests par immunocapture, qui évitent la compétition avec les anticorps IgG et l’interférence des facteurs rhumatoïdes.
• quantification des anticorps IgM varie en fonction des modalités de calcul des index de positivité.

Techniques particulières
• ELIFA (Enzyme Linked Immuno Filtration Assay)
- technique complexe, non commercialisée, réservée aux laboratoires très spécialisés.
- consiste à séparer dans un premier temps les différents éléments d’une suspension antigénique complexe par électrosynérèse, puis à révéler les arcs de précipitation obtenus par une technique enzymo-immunologique.
- on peut ainsi analyser finement la réponse en anticorps contre les différents antigènes et comparer des sérums ou des prélèvements appariés (sérum maternel-sérum du cordon ou sérum-humeur aqueuse par exemple).

 •  Immuno-empreinte - le principe est globalement le même que le précédent, mais la séparation des éléments de la suspension toxoplasmique est effectuée par électrophorèse en gel puis transfert sur une bande de nitrocellulose. Cette dernière est mise en contact avec le sérum à tester, puis la révélation est effectuée par un anticorps anti-immunoglobulines humaines marqué à la peroxydase. Cette technique est utilisée chez un nouveau-né pour différencier les IgG maternelles des IgG synthétisées par l’enfant.

Question 25

Techniques ELISA ?

Answer 25

• Technique ELISA très utilisée: simplicité et automatisation
• Deux techniques sont disponibles en fonction de ‘isotype que l’on souhaite titrer

ELISA indirecte “classique” pour rechercher et titrage des IgG
> antigènes fixés sur uune phase solide, mis en contact avec le sérum
> si des IgG spécifiques existent, elles restent fixées après lavage
> ajout d’un Ac anti-immunoglobuline humaine couplée à une enzyme qui se fixe sur les IgG
- enzyme transforme un substrat incolore en produit coloré dont on mesure la densité optique
=> avantages: lecture objective des réactions, possibilité de traiter de grandes séries, résultats reproductibles pour une large gamme de titre

ELISA inverse (immunocapture) pour rechercher et titrage des IgM et IgA : 
> un Ac spécifique d'une classe d'Ig humaine est fixé sur une phase solide
> Ig de cette classe contenues dans le sérum testé sont retenues après lavage
> antigène couplé à une enzyme est ajouté, mettant en évidence les Ig de la spécificité recherchée
> enzyme transforme un substrat incolore en produit coloré dont on mesure la DO (densité optique)
=> avantages : idem et la saturation des sites antigéniques (par le volume des IgM et IgA) évite l'interférence avce les IgG et facteurs rhumatoïdes
=> inconvénients : pas de relation liénaire DO-quantité d'Ig donc évaluatio semi-quantitave sous forme d'index de fixation

Question 26

ISAGA

Answer 26

utilise des toxoplasmes formolés et permet la mise en évidence d’IgM et d’IgA par immunocapture.

Expression du résultat sous forme de score semi-quantitative : de 0 à 5+ résultat négatif, de 6 à 8+ résultat équivoque, de 9 à 12 + résultat positif

=> avantages : simple de réalisation, pas d’influence de facteurs rhumatoïdes, grande sensibilité (détection précoce)
=> inconvénients : grande sensibilité => persistance d’un score élevé parfois longtemps après une primo-infection

Agglutination après immunocapture :
la réaction ISAgA (Immuno-Sorbent Agglutination Assay) est une variante de l’agglutination directe, mais après capture des anticorps IgM, éventuellement IgA, sur phase solide sensibilisée par un anticorps anti-IgM (-IgA) humaines. En cas de positivité, les parasites sont uniformément répartis sous forme de voile tapissant le fond de la cupule réactionnelle. L’image obtenue permet d’établir un score (0 à 12). Ce test est simple à réaliser, il n’est pas influencé par la présence éventuelle de facteur rhumatoïde. Il est commercialisé. Très sensible, il permet de détecter précocement la présence des IgM anti-toxoplasme, mais reste positif de nombreux mois.

Question 27

IFI ?

Answer 27

utilise des tachyzoïtes formolés, fixés sur des lames à puits

Le sérum à différentes dilutions, est incubé et la fixation des IgG e IgM spécifiques est révélée par un Ac anti-immunoglobuline couplé à la flurescéine
= lecture au microscope à fluorescence pour déterminer le titre, représenté par la dernière dilution pour laquelle la membrane du tachyzoïte apparaît bien fluorescente

=> inconvénients : faux positifs avec les facteurs rhumatoïdes et parfois anti-nucléaires, faux négatifs possible sur les IgM en cas de fort taux d’IgG par saturation des sites antigéniques (traitement préalable par un adsorbant des IgG recommandés), lecture longue

test classique utilisant des toxoplasmes formolés fixés sur une lame. En fonction de l’anti-immunoglobuline marquée utilisée, il permet de détecter les différents isotypes d’anticorps (test de Remington pour la détection et le titrage des IgM). Il est simple à réaliser mais la lecture nécessite un observateur entraîné. Les réactifs sont commercialisés.

Question 28

Comparaison de profils immunologiques ?

Answer 28

2 techniques principalement

1) ELIFA
1er temps : électrosynérèse avec un Ag soluble de T. gondii
2e temps : révélation des arcs de précipitations par méthode immuno-enzymatique

=> avantages : intéret majeur pour comparer des sérums appariés (mère et cordon par ex) en mettant nettement en évidence de nouveaux arcs précipitants ou un renforcement d’un arc déjà présent

2) Immunoblots (Western lot) schématiquement :
-migration électrophorétique d’un antigène de T. gondii
-électrotransfert sur membrane nitrocellulose
-incubation avec le/les sérums à tester
- révélation immuno-enzymatique des AC spécifiques
-comparaison des profils immunologiques
=> avantages : seule méthode d’analyse précise de la spécificité des Ac
=> inconvénient : technique longue et onéreuse.

Question 29

Comment apprécier la durée d’évolution de l’infection ?

Answer 29

-mesure de l’avidité des IgG
> avidité = affinité fonctionnelle d’un ensemble d’anticorps dirigés contre un ensemble d’antigènes
> avidité des IgG augmente avec le temps d’évolution de l’infection, atteint une valeur maximale qui reste stable ensuite.
> Schématiquement, on mesure, pour un même sérum, l’intensité de la réaction Ag-Ac par méthode ELISA classique en absence et en présece d’un agent dissociant de concentration croissante (urée souvent)
=> indice d’avidité élevé permet de conclure à une infection ancienne (seuil dépendant de la technique utilisée)

• agglutination différentielle HS/AS qui compare les titres d’IgG obtenus en agglutination avec une préparation de toxoplasmes fixés soit par formol (HS), soit par méthanol
  => au début les titres sont comparables. Après 6 mois à 1 an d’évolution, les titres d’IgG en AC diminuent et se négativent alors que les titres d’IgG en HS persistent à un taux +/- élevé

Question 30

traitement de toxoplasmose ?

Answer 30

• médicament idéal devait agir sur les kystes et le tachyzoïtes, avoir une bonne diffusion tissulaire, avoir une bonne concnetration intracellulaire, avoir une bonne tolérance, et être dénué d’effet tératogène : AUCUN traitement actuel ne répond à tous ces critères
• deux grandes familles uniquement actives sur les tachyzoïtes :

> inhibiteurs de la synthèse de l’acide folique

• pyriméthamine, le plus actif, parasiticide sur les tachyzoïtes
• triméthoprime, également actif, à des concnetrations plus élevées
• bonne diffusion tissulaire, franchissent le placenta avec risques tératogènes démontrés chez l’animal : CI durant le 1er trimestre !

> sulfamides = inhibe la dihydropteroate synthase (DHPS)

• sulfadiazine et sulfamthoxazole (BACTRIM) surtout
• bonne diffusion tissulaire, franchissent le placenta
• toxicité hématologique : surveillance NFS lors de traitement prolongé, toxicité rénale type cristallurie => diurèse alcaline, toxicité immuno-allergique cutanée (rash, éruption, syndrome de Stevens-Johnson et Lyell) chez le patient VIH + particulièrement

=> association sulfamide / inhibiteur de la dihydrofolate réductase hautement synergique “par un effet en cascade” + ajout d’acide folinique

• inhibiteurs de la dihydrofolates réductase
• sulfamides

> macrolides sont parasitostatiques sur T. gondii à doses élevées (mauvaise diffusion dans certains organes : cerveau, oeil)

• diffusion tissulaire moyenne voire quasi-nulle (au niveau cérébral notamment) ce qui limite leur utilisation dans les formes graves
• spiramycine (ROVAMYCINE) se concentre particulièrement dans le placenta et permet donc de réduire la transmission materno-foetale du parasite
• supériorité clinique de nouveaux macrolides (azythro, clarithro, roxithromycine) n’est pas démontrée
• clindamycine (famille des lincosamides) en association à la pyriméthamine peut être utilisée en 2e intention dans le traitement de la toxoplasmose cérébrale et oculaire
• atovaquone est la seule molécule à la fois active sur les tachyzoïtes et les kystes. Utilisation limitée du fait de sa mauvaise biodisponibilité (pas d’AMM)

Question 31

Stratégies thérapeutiques : primo-infection immunocompétent ?

Answer 31

abstention thérapeutique sauf si asthénie très invalidante

spiramycine PO - 1 mois
3g/j chez l’adulte
50 mg/kg/j chez l’enfant

Question 32

Stratégies thérapeutiques : toxoplasmose cérébrale ID ?

Answer 32

> 1ere ligne
- pyriméthamine 100mg/j 24h puis 50-75mg/j
+ sulfadiazine 4-6g/jour per os

+ acide folinique (pour limiter anémie mégaloblastique)
+ traitement anticonvulsivant
→ jusqu’à accouchement

> Alternative si intolérance à la sulfadiazine
pyriméthamine + clindamycine 2,4g/j per os

6 semaines; traitement d’entretien à demi-dose

Question 33

Femme enceinte en séroconversion : Stratégies thérapeutiques?

Answer 33

-spiramycine 6-9 MUI/

réduire le risque de transmission materno-foetale

Question 34

Femme enceinte, amniocentèse - : Stratégies thérapeutiques?

Answer 34

-spiramycine 9 MUI/j jusqu’à accouchement

• Suivi échographique mensuel de la mère et traitement par Spiramycine
• Diagnostic prénatal possible à partir de la 18ème SA, en respectant un délai de 4 semaines après la date supposée de l’infection
  → se fait par amniocentèse (recueil de 10-20 mL de liquide amniotique, ne pas oublier d’informer et de recueillir le consentement de la patiente)
• Recherche de l’ADN de Toxoplasma gondii par PCR sur le liquide amniotique, si positif : traitement de la patiente par PSA (Pyriméthamine + Sulfadiazine + Acide folinique) jusqu’à l’accouchement, puis effectuer un profil comparé des Ac NN/Mère pour confirmer la toxoplasmose congénitale
• Suivi +++ de l’enfant pour complication pendant un an : examen oculaire fond d’oeil, sérologie, recherche d’ADN par PCR…

Question 35

Femme enceinte, amniocentèse + : stratégies thérapeutiques?

Answer 35

• Diagnostic prénatal possible à partir de la 18ème SA, en respectant un délai de 4 semaines après la date supposée de l’infection
• Recherche de l’ADN de Toxoplasma gondii par PCR sur le liquide amniotique
  → se fait par amniocentèse (recueil de 10-20 mL de liquide amniotique, ne pas oublier d’informer et de recueillir le consentement de la patiente)

1ere ligne

• pyriméthamine + sulfadiazine jusqu’à accouchement + acide folinique ((pour limiter anémie mégaloblastique)
• Effectuer un profil comparé des Ac NN/Mère pour confirmer la toxoplasmose congénitale
• Suivi +++ de l’enfant pour complication pendant un an : examen oculaire fond d’oeil, sérologie, recherche d’ADN par PCR…
• si ø séquelle : pas de traitement
• si cicatrice rétinienne : - même traitement pour l’enfant pendant 1 an
• si échographie cérébrale anormale : - même traitement pour l’enfant pendant 1 an
• si rétinite aigue : traitement anti parasitaire + antiinflammatoires

Alternative
Si anomalie graves à l’échographie, discussion d’une intéruption thérapeutique de grossesse

Question 36

Stratégies prophylactiques

Answer 36

Mesures individuelles essentielles chez la femme enceinte non immune
☞ Contamination par des formes BRADYZOÏTES contenues dans des « kystes viscéraux » formés par le parasite dans les muscles de l’animal (+++ mouton, boeuf).
- Congélation (-15°C pendant > 3 jours) et/ou cuisson suffisante de la viande (> 67°C)

☞ Contamination par les formes KYSTIQUES (= oocystes) de Toxoplasma gondii éliminées par les fèces du chat (Hôte définitif et réservoir du parasite). Ces oocystes renferment la forme infectante, les sporozoïtes

• Lavage minutieux des crudités et légumes, lavage des mains et des ustensiles de cuisine après avoir éplucher les crudités et fruits, nettoyage régulier du frigo
• Port de gants lors du jardinage ou changement de litière du chat + lavage des mains après (nettoyage du bac à litière tous les jours à ≥ 70°C)

☞ Repas en dehors du domicile : éviter la consommation de crudités, préférer les légumes cuits ; consommer la viande bien cuite ou privilégier la consommation de poisson cuit

☞ Surveillance sérologique mensuelle (obligatoire en France, arrêté réglementaire) : recherche des IgG et IgM spécifiques pour détecter une primo- infection à Toxoplasma gondii éventuelle.

-Chimioprophylaxie en fonction de la situation clinique du malade

Question 37

Chimioprophylaxie en fonction de la situation clinique du malade

Answer 37

Patient VIH + : recommandées : surveillance sérologique tous les 6 mois si dépistage négatif lors du bilan initial.
→ prophylaxie primaire
- 1ere ligne : cotrimoxazole 1/j
- alternatives : dapsone 50mg/j + pyriméthamine 50mg/semaine + acide folinique 25 mg/semaine
ou atovaquone (hydroxynaphtoquinone : inhibition de la chaine respiratoire mitochondriale
Si sérologie positive et CD4 < 100/mm^3 - arrêt si CD4 > 200/mm³ pendant 6 mois (= 2 prélèvements à 3 mois d’intervalle)

NB : dapsone = Dérivé sulfoné inhibant les fonctions cytotoxiques et l’activité des lysosomes des polynucléaires neutrophiles.
L’oxalate de fer associé réduit le risque d’anémie hypochrome lié à l’utilisation prolongée de la dapsone.

Traitement curatif
☞ Pyriméthamine + sulfadiazine + acide folinique
☞ Au moins 6 semaines

→ prophylaxie secondaire

• 1ere ligne : idem que le traitement curatif mais à demi-dose : pyriméthamine + sulfadiazine + acide folinique (assure aussi la prophylaxie à la pneumocystose)
• alternatives : cotrimoxazole (Bactrim Forte) 1/j ou atovaquone + pyriméthamine + ac. folinique
• arrêt si CD4 > 200, pendant 6 mois

Question 38

Traitements en bref de toxoplasmose ?

Answer 38

-spiramycine
> femme enceinte avec séroconversion pdt la grossesse

-Pyriméthamine + sulfadiazine + acide folinique
> contamination foetale avérée
> femme enceinte si séroconversion après 36 SA
> nouveau-né et nourrissons contaminés
> en curatif chez l’immunodéprimé, demi-dose en prophylaxie secondaire jusqu’à CD4 > 200/mm¨3 pendant au moins 6 mois / traitement ARV efficace

-Cotrimoxazole
> en prophylaxie primaire chez l’immunodéprimé (si CD4<200/mm³ )
> en prophylaxie secondaire en alternative

Question 39

Quels sont les agents microbiologiques recherchés chez une femme enceinte ?

Answer 39

Virus :
• Rubéole : 1er trimestre, obligatoire. Si résultat négatif : surveillance jusqu’à la 20 SA
• Virus de l’hépatite B : au 6ème mois, obligatoire
• VIH, au 1er trimestre, systématiquement proposé

Bactéries :
• Agent de la syphillis : Treponema pallidum
• Streptocoque du goupe B : Streptococcus agalactiae. Entre le 8e et le 9e mois, systématiquement proposé

Parasite :
• Toxoplasmose : au 1er trimestre, obligatoire. Si résultat négatif : sérologie mensuelle, dernier
contrôle après l’accouchement

Question 40

Dépistages obligatoires ou systématiquement proposés lors de la grossesse ?

Answer 40

Rubéole : OBLIGATOIRE Au 1er trimestre
Syphilis : OBLIGATOIRE Au 1er trimestre
Toxoplasmose : OBLIGATOIRE Au 1er trimestre
Hépatite B : OBLIGATOIRE Au 6ème mois

VIH Systématiquement proposé Au 1er trimestre
SGB Systématiquement proposé Entre 8ème et 9ème mois