ISH - KEI Flashcards
Molécules ciblées par l’hybridation in situ
Acides nucléïques (ADN et ARN)
Techniques basées sur l’hybridation de séquences nucléiques
- Southern blot (ADN)
- Northern blot (ARN)
- PCR
- FISH
- CISH
- CGH Array
Principe de base de l’hybridation in situ
Complémentarité des paires de bases (A avec T ou U et G avec C)
Avantages de l’hybridation in situ
- Préservation de l’intégrité cellulaire et tissulaire +++
- Réalisable sur des noyaux interphasiques et métaphasiques
- Applicable à plusieurs types de spécimens
- Fonctionne sur des tissus fixés au formol et inclus en paraffine
Types de spécimens analysés par hybridation in situ
- Cultures Cellulaires
- Tissus FFPE
- Frottis par aspiration à l’aiguille
- Empreintes tissulaires
- Préparations en milieu liquide
Les différents types de sondes d’hybridation
- Sonde ADN
- Sonde ARN
- Sonde oligonucléotide
- Sondes modifiées : PNA, LNA
Types d’hybrides avec la liaison la plus forte/stable par ordre décroissant
- ARN-ARN
- ADN-ARN
- ADN-ADN
Indications cliniques de l’hybridation in situ
- Diagnostic d’anomalies génétiques constitutionnelles (chromosomiques et géniques)
- Phénotypage tumoral (anomalies génétiques somatiques)
- Détection d’infections
Définition de la dénaturation
- Séparation d’un complexe double brin par rupture des liaisons hydrogène (perte de la conformation secondaire)
- Obtenue par :
- Chauffage
- Exposition à un milieu salin ou à un solvant très polaire (urée ou formamide)
- Obtenue par :
Définition de la température de fusion (ou Tm, pour « melting »)
Température à laquelle 50% des molécules double brins sont dénaturées

Différence entre renaturation et hybridation
Les deux correspondent à la formation de liaisons hydrogène entre deux simples brins
- Renaturation : les deux brins réassociés sont issus du même type de molécule initial
- Hybridation : les deux brins sont issus de deux types de molécules différents
- ADN/ARN, ADN de deux espèces différentes, ADN/sonde…
Facteurs qui influencent la dénaturation (température de fusion, Tm)
- ↑ Tm avec :
- ↑ nombre de liaisons H-H (soit la longueur du fragment)
- ↑ en bases C≡G
- ↑ sels monovalents
- ↓ Tm avec :
- Présence de mésappariement (% de non homologie)
- Urée
- Formamide
- pH extrêmes
Facteurs qui influencent la renaturation/hybridation
- Température
- Concentration
- Temps
- Taille des fragments
- Complexité des fragments
- % d’homologie
Vrai ou faux : L’hybridation de deux brins d’acides nucléiques non parfaitement complémentaires est-elle possible ?
Vrai
Hybridation non spécifique
Dépend des conditions d’hybridation (stringence)
Facteurs qui influencent la stringence (spécificité) de l’hybridation
- ↑ stringence (hybridation plus difficile c. à d. moins sensible mais plus spécifique) avec :
- ↑ Tm
- ↓ [Na+]
Méthodes de marquage des sondes
- Marquage interne (= uniforme)
- Translation de coupure (Nick-translation)
- Amorçage aléatoire (Random-priming)
- Au cours de la synthèse des brins par PCR
- Marquage externe : à l’extrémité 5’ ou 3’
Types de marquage des sondes
- Radioactif (« sondes chaudes »)
- Marquage non radioactif (« sondes froides »)
- Fluorescents (FISH) (microscope à fluorescence)
- Non-fluorescents (microscope optique)
- Biotine (« sondes biotynilées »)
- Digoxigénine
- Enzymes (phosphatase alcaline, peroxidase)
- Or colloidal (microscope électronique)
Techniques de révélation/détection de l’hybridation in situ
Principales étapes techniques de l’hybridation in situ

- Quelle étape est la plus critique de la technique d’hybridation in situ
- Que permet-elle de corriger ?
- Étape de digestion à la protéase (protéolyse)
- Corrige le temps de fixation
NB. La protéase permet de digérer les ponts protéiques créés par la fixation au formol qui peut masquer les acides nucléiques, donc empêcher d’avoir un signal
Fixateur recommandé pour les tissus pour une analyse par hybridation in situ
Formol tamponné 10 % pendant 24 h (*8-12h dans le document?) à température ambiante (18 à 25 °C)
Précautions à prendre durant la technique d’hybridation in situ (manipulations, préparation du matériel et des solutions)
- Port de gants
- Nettoyage du matériel et des surfaces avec de l’alcool
- Surfaces et matériel nettoyés dédiés à l’hybridation
NB. L’ADN et l’ARN peuvent être dégradés par l’activité nucléase (présente sur la peau)
Causes d’un signal faible ou d’absence de signal d’hybridation in situ
-
Étape de préparation des tissus
- Lames incomplètement déparaffinées
- Lames non déshydratées ou égouttées avant l’ajout de sonde
- Sur-fixation
- Digestion insuffisante
-
Étape de l’hybridation
- Sonde insuffisamment biotinylée
- Sonde trop diluée
- Sonde ou cible ADN insuffisamment dénaturé
- Sonde évaporée
- Hybridation incomplète
- Tampon de mauvais pH
- Concentration du tampon de lavage astringent trop basse
- Réactifs trop froids
-
Étape de détection
- Microscope à fluorescence mal réglé
- Mauvais sets de filtres utilisés
- Sondes/fluorochromes endommagés par la lumière
Comment déterminer si l’absence de signal est due à un problème technique ou à l’absence de la séquence cible dans l’échantillon examiné ?
Évaluer les témoins positifs























