ISH - KEI Flashcards
Molécules ciblées par l’hybridation in situ
Acides nucléïques (ADN et ARN)
Techniques basées sur l’hybridation de séquences nucléiques
- Southern blot (ADN)
- Northern blot (ARN)
- PCR
- FISH
- CISH
- CGH Array
Principe de base de l’hybridation in situ
Complémentarité des paires de bases (A avec T ou U et G avec C)
Avantages de l’hybridation in situ
- Préservation de l’intégrité cellulaire et tissulaire +++
- Réalisable sur des noyaux interphasiques et métaphasiques
- Applicable à plusieurs types de spécimens
- Fonctionne sur des tissus fixés au formol et inclus en paraffine
Types de spécimens analysés par hybridation in situ
- Cultures Cellulaires
- Tissus FFPE
- Frottis par aspiration à l’aiguille
- Empreintes tissulaires
- Préparations en milieu liquide
Les différents types de sondes d’hybridation
- Sonde ADN
- Sonde ARN
- Sonde oligonucléotide
- Sondes modifiées : PNA, LNA
Types d’hybrides avec la liaison la plus forte/stable par ordre décroissant
- ARN-ARN
- ADN-ARN
- ADN-ADN
Indications cliniques de l’hybridation in situ
- Diagnostic d’anomalies génétiques constitutionnelles (chromosomiques et géniques)
- Phénotypage tumoral (anomalies génétiques somatiques)
- Détection d’infections
Définition de la dénaturation
- Séparation d’un complexe double brin par rupture des liaisons hydrogène (perte de la conformation secondaire)
- Obtenue par :
- Chauffage
- Exposition à un milieu salin ou à un solvant très polaire (urée ou formamide)
- Obtenue par :
Définition de la température de fusion (ou Tm, pour « melting »)
Température à laquelle 50% des molécules double brins sont dénaturées
Différence entre renaturation et hybridation
Les deux correspondent à la formation de liaisons hydrogène entre deux simples brins
- Renaturation : les deux brins réassociés sont issus du même type de molécule initial
- Hybridation : les deux brins sont issus de deux types de molécules différents
- ADN/ARN, ADN de deux espèces différentes, ADN/sonde…
Facteurs qui influencent la dénaturation (température de fusion, Tm)
- ↑ Tm avec :
- ↑ nombre de liaisons H-H (soit la longueur du fragment)
- ↑ en bases C≡G
- ↑ sels monovalents
- ↓ Tm avec :
- Présence de mésappariement (% de non homologie)
- Urée
- Formamide
- pH extrêmes
Facteurs qui influencent la renaturation/hybridation
- Température
- Concentration
- Temps
- Taille des fragments
- Complexité des fragments
- % d’homologie
Vrai ou faux : L’hybridation de deux brins d’acides nucléiques non parfaitement complémentaires est-elle possible ?
Vrai
Hybridation non spécifique
Dépend des conditions d’hybridation (stringence)
Facteurs qui influencent la stringence (spécificité) de l’hybridation
- ↑ stringence (hybridation plus difficile c. à d. moins sensible mais plus spécifique) avec :
- ↑ Tm
- ↓ [Na+]
Méthodes de marquage des sondes
- Marquage interne (= uniforme)
- Translation de coupure (Nick-translation)
- Amorçage aléatoire (Random-priming)
- Au cours de la synthèse des brins par PCR
- Marquage externe : à l’extrémité 5’ ou 3’
Types de marquage des sondes
- Radioactif (« sondes chaudes »)
- Marquage non radioactif (« sondes froides »)
- Fluorescents (FISH) (microscope à fluorescence)
- Non-fluorescents (microscope optique)
- Biotine (« sondes biotynilées »)
- Digoxigénine
- Enzymes (phosphatase alcaline, peroxidase)
- Or colloidal (microscope électronique)
Techniques de révélation/détection de l’hybridation in situ
Principales étapes techniques de l’hybridation in situ
- Quelle étape est la plus critique de la technique d’hybridation in situ
- Que permet-elle de corriger ?
- Étape de digestion à la protéase (protéolyse)
- Corrige le temps de fixation
NB. La protéase permet de digérer les ponts protéiques créés par la fixation au formol qui peut masquer les acides nucléiques, donc empêcher d’avoir un signal
Fixateur recommandé pour les tissus pour une analyse par hybridation in situ
Formol tamponné 10 % pendant 24 h (*8-12h dans le document?) à température ambiante (18 à 25 °C)
Précautions à prendre durant la technique d’hybridation in situ (manipulations, préparation du matériel et des solutions)
- Port de gants
- Nettoyage du matériel et des surfaces avec de l’alcool
- Surfaces et matériel nettoyés dédiés à l’hybridation
NB. L’ADN et l’ARN peuvent être dégradés par l’activité nucléase (présente sur la peau)
Causes d’un signal faible ou d’absence de signal d’hybridation in situ
-
Étape de préparation des tissus
- Lames incomplètement déparaffinées
- Lames non déshydratées ou égouttées avant l’ajout de sonde
- Sur-fixation
- Digestion insuffisante
-
Étape de l’hybridation
- Sonde insuffisamment biotinylée
- Sonde trop diluée
- Sonde ou cible ADN insuffisamment dénaturé
- Sonde évaporée
- Hybridation incomplète
- Tampon de mauvais pH
- Concentration du tampon de lavage astringent trop basse
- Réactifs trop froids
-
Étape de détection
- Microscope à fluorescence mal réglé
- Mauvais sets de filtres utilisés
- Sondes/fluorochromes endommagés par la lumière
Comment déterminer si l’absence de signal est due à un problème technique ou à l’absence de la séquence cible dans l’échantillon examiné ?
Évaluer les témoins positifs
Interprétation des témoins internes et externes en l’absence de signal sur les coupes examinées
Évaluer les témoins positifs
- Témoins externes et internes négatifs –> problème de l’hybridation/détection
- Témoins externes positifs et internes négatifs –> problème de préparation des tissus
- Témoins externes négatifs et internes positifs –> Faux positif
- Témoins externes et internes positifs – > Absence de la séquence cible
Causes d’hybridation non spécifique ou de bruit de fond élevé
- Échantillon riche en globules rouges/pigments
- Déparaffinage incomplet
- Prétraitement protéolytique trop fort
- Étape de blocage insuffisante
- Sonde trop concentrée
- Les lames ont refroidi avant l’hybridation
- Les lames ont séché pendant l’incubation
- Incubation trop longue
- Lavages trop courts
- Concentration du tampon de lavage astringent trop élevée
Comment identifier une hybridation non spécifique ?
Évaluer les témoins négatifs** ET les **témoins positifs
Causes d’un témoin positif “négatif” (pas de signal dans le témoin positif)
- Mauvaise sonde
- Mauvais réactifs (mauvais stockage)
- Pas de digestion (enzymes instables)
- Pas de dénaturation
- Étape omise dans le protocole
- Réactifs de détection mal mélangés
Les types d’hybridation in situ utilisés en pathologie
- Fluorescente (FISH)
- Chromogéniques (CISH)
- Argentique (SISH)
- Dual-color SISH
Les types séquences ciblées par les sondes de FISH
-
Grandes séquences chromosomiques
- Grandes régions, bras court, bras long
-
Séquences répétitives
- Centromères
-
Séquences uniques
- Gènes spécifiques, parties de gènes
Anomalies détectées/ évaluées par l’hybridation in situ
- Anomalies de nombre des chromosomes
- Translocations chromosomiques
- Délétion d’un gène ou chromosome
- Amplification de gènes
- Agents infectieux
- Expression génique
Interpréter cette image
- Sondes d’énumération chromosomiques
- Rouge : chromosome 21
- Vert : chromosome 13 (témoin interne)
3 signaux rouges avec 2 signaux verts : trisomie 21
Interpréter cette image
- Rouge : 1p
- Vert : 1q
1 signal rouge et 2 signaux verts (témoin interne) : délétion 1p
Interpréter cette image
- Cancer gastrique, Dual-CISH
- Noir : gène ERBB2 (HER2) :
- Rouge : Centromère 17 (CEP17)
Signaux noirs >>> signaux rouges : Amplification HER2
En FISH, quel aspect prend un réarrangement avec une SONDE DE SÉPARATION (BREAK-APART) ?
- A. 1 paire de signaux de couleurs différentes fusionnés et 2 signaux de couleurs séparés
- B. 2 paires de signaux de couleurs différentes fusionnés
- C. 3 signaux de couleurs différentes séparés
- D. 4 signaux de couleurs différents séparés
A. 1 paire de signaux de couleurs différentes fusionnés et 2 signaux de couleurs séparés
En FISH, quel aspect prend un réarrangement avec une SONDE DE FUSION ?
- A. Une paire de signaux de couleurs différentes fusionnés et 2 signaux de couleurs différentes séparés
- B. 2 paires de signaux de couleurs différentes fusionnés
- C. 3 paires de signaux de couleurs différentes fusionnés
- D. 4 signaux de couleurs différentes séparées
A. Une paire de signaux de couleurs différentes fusionnés et 2 signaux de couleurs différentes séparés
Interpréter cette image de CISH EBER
EBER positif : nombreux signaux nucléaires bleus foncés/noirs avec contre-coloration rouge pâle (Kernechtrot)
Interpréter cette image de sonde de séparation (Break-Apart)
Un signal vert et un signal orange séparés : Réarrangement
Quelle distance entre les signaux est considérée comme une séparation d’une sonde Break-Apart ?
Une distance de 3 x le diamètre d’un signal
N.B. : 2 ou 3 signaux de même taille, séparés par une distance ≤ 1 au diamètre du signal doivent être comptés comme un seul signal
Dans quelles situations une dissociation/séparation d’une sonde Break-apart ne doit pas être évaluée ?
- Cas de polysomie élevée
- Cas d’amplification du gène
En FISH, il y a amplification du gène ERBB2 dans le cancer du sein si :
- A. Le ratio HER 2/CEP17 ≥ 2
- B. Le nombre de signaux HER2 ≥ 4
- C. Le nombre de signaux HER2 ≥ 6
- D. Le ratio HER 2/CEP17 ≥ 2 ET le nombre de signaux HER2 ≥ 4
D. Le ratio HER 2/CEP17 ≥ 2 ET le nombre de signaux HER2 ≥ 4
En FISH, il y a ABSENCE d’amplification du gène ERBB2 dans le cancer du sein si :
- A. Le ratio HER 2/CEP17 < 2
- B. Le nombre de signaux HER2 < 4
- C. Le nombre de signaux HER2 ≥ 4 et < 6
- D. Le ratio HER 2/CEP17 < 2 ET le nombre de signaux HER2 < 4
D. Le ratio HER 2/CEP17 < 2 ET le nombre de signaux HER2 < 4
Interpréter cette image de FISH (cancer du sein)
- Rouge : gène ERBB2 (HER2)
- Vert : Centromère 17 (CEP17)
2 signaux rouges et deux signaux verts par noyau : Absence d’amplification HER2
(ratio HER 2/CEP17 < 2 et nombre de signaux HER2 < 4)
Interpréter cette image de FISH (cancer du sein)
- Rouge : gène ERBB2 (HER2)
- Vert : Centromère 17 (CEP17)
> 4 signaux rouges et 2 à 4 signaux verts par noyau : amplification HER2
(ratio HER 2/CEP17 ≥ 2 ET nombre de signaux HER2 ≥ 4)
Interpréter cette image de FISH (cancer du sein)
- Rouge : gène ERBB2 (HER2)
- Vert : Centromère 17 (CEP17)
3 signaux rouges et 1 signal vert par noyau : monosomie 17
N.B : investiguer davantage, le résultat sera classé positif ou négatif selon l’immunohistochimie HER2
Interpréter cette image de FISH (cancer du sein)
- Rouge : gène ERBB2 (HER2)
- Vert : Centromère 17 (CEP17)
Plusieurs signaux rouges et plusieurs signaux verts par noyau : polysomie 17
N.B : investiguer davantage, le résultat sera classé positif ou négatif selon l’immunohistochimie HER2
Interpréter cette image de FISH (cancer du sein)
- Rouge : gène ERBB2 (HER2)
- Vert : Centromère 17 (CEP17)
Composante invasive non amplifiée juxtaposée à composante in situ amplifiée
N.B :
- Difficulté en microscopie à fluorescence
- Localiser le cancer infiltrant (micro-infiltrant)
- Distinguer le cancer infiltrant du cancer in situ
- à Importance de la concordance avec les lames H&E et IHC (p63, s-myosine)
Quels énoncés sont vrais à propos de la lecture automatisée (Metasystem) de la FISH pour HER2 dans le cancer du sein
- A. Donne un résultat moyen par tuile
- B. Donne un résultat moyen par noyau
- C. Excellent système pour générer des ratios HER2/CEP17
- D. 50% des cas nécessitent un décompte manuel
- E. Peut sortir les catégories particulières (groupes 2, 3 et 4) de résultats FISH
A.Donne un résultat moyen par tuile
C.Excellent système pour générer des ratios HER2/CEP17
D. 50% des cas nécessitent un décompte manuel
Quels énoncés sont vrais à propos du décompte manuel de la FISH pour HER2 dans le cancer du sein
- A. Minimum 20 noyaux exigé par ASCO/CAP
- B. Minimum 60 noyaux exigé par ASCO/CAP
- C. À faire dans les cas de FISH particuliers, ratios près de 2.0
- D. À faire dans tous les cas difficiles, ambigus
- E. 2e lecteur pour tous les cas équivoques, les cas positifs par le nombre de HER2 par noyau, cas difficiles
- F. 3e lecteur dans les cas de discordance
A. Minimum 20 noyaux exigé par ASCO/CAP (Minimum de 60 à HSS)
C. À faire dans les cas de FISH particuliers, ratios près de 2.0
D. À faire dans tous les cas difficiles, ambigus
E. 2e lecteur pour tous les cas équivoques, les cas positifs par le nombre de HER2 par noyau, cas difficiles
F. 3e lecteur dans les cas de discordance
