Hst 7: Elektronen microscopie

Question 1

Waarom was er nood aan EM? Vergelijk het met fluorescentie microscopie

Answer 1

Bij fluorescentie microscopie waren :
> we zien moleculen niet op ware grootte (dit oa omdat we labels gebruiken, en ook niets onder 200 nm kunnen zien bij bepaalde fluorescentie technieken)

> we zien niet alles wat aanwezig is , want er worden merkers gebruikt om structuren aan te kleuren
(vb: je hebt niet genoeg labels gebruikt?> niet alles gekleurd)

Question 2

Hoe komt het dat elektronen kunnen gebruikt worden voor microscopie?

Answer 2

• Elektronen gedragen zich als een golf, als ze voldoende versneld worden.
• Elektronen hebben een lagere golflengte dan licht -> resolutie verbeterd (lage golflengte = lage D)
• Elektronen kunnen afgebogen worden door een elektromagnetische veld -> focussering mogelijk gebruikmakend van een magnetische lens
• Elektronen interageren met het weefsel in een elastische/inelastische wijze .

Dit kan info verlenen over het weefsel zelf

Question 3

Bespreek transmissie EM (TEM)

Answer 3

-we detecteren primaire elektronen die elastisch interageren : die rechtdoor lopen (= geen interactie, brightfield ) , of elastisch interactie hebben en verstrooien (darkfield)
Dit geeft beeld over ultrastructuur

• resolutie van op 0.1 nm structuren (1 Angstrom)
• heeft 2 componenten: brightfield en darkfield

Bespreking:
brightfield : een apertuu laat enkel onverstrooiide elektronen door , en deze worden gedetecteerd.

(deze onverstrooinde regios kleuren licht -> witte achtergrond)

Darkfield: Door diezelfde apertuur te verschuiven kunnen we enkel verstrooide elektronen doorlaten
(= zwarte achtergrond)

> Om meer contrast te creeren in de dunne coupes, gebruiken we zware metalen (vb lood)

(je kan ook selectief kleuren, door antilichamen te labelen met goud)

Question 4

Bespreek scanning EM (SEM)

Answer 4

• Je kijkt naar :backscatter en secundaire elektronen.
• lagere voltage én resolutie

Secundair elektronen (main players):
-> Lagere voltage

• > geven beeld over het reliëf van het staal
• > Backscatter elektronen: primaire elektronen die diep in de staal worden teruggekaatst = backscatter elektronen
• dense structuren hebben meer backscatter -> intensiteit schaalt met atoomgetal (= atoomnummer)

lagere voltage zodat kleine interactie volume is, en in geval van SEM = resolutie verbetering, omdat beeld minder breed is

Question 5

Bespreek brightfield, en darkield microscopie in TEM

Answer 5

brightfield : een apertuu laat enkel onverstrooiide elektronen door , en deze worden gedetecteerd.

(deze onverstrooinde regios kleuren licht)

Darkfield: Door diezelfde apertuur te verschuiven kunnen we enkel verstrooide elektronen doorlaten

(= deze verstrooiende regios kleuren licht)

• analoog aan darkfield in licht microscopie (= zwarte achtergrond)
• als je goud partikels gebruikt, zullen deze ook sterk zwart kleuren.

Question 6

Bespreek de keuze van voltage in SEM

Answer 6

SEM gebruikt liefst lagere voltages , om meer interactie volume te hebben

*hoge voltages zorgen voor een bredere interactie volume: versnelde elektronen kunnen los door het weefsel gaan (weerkaatsen?).

Netto is er een hogere diepte zicht, maar het weefsel zelf kleurt volledig wit= verlies van resolutie.

(zie slide 1 p 8)

Question 7

Bespreek backscatter elektronen. Wat is hun voordeel in SEM?

Answer 7

Backscatter elektronen, zijn elektronen die diep in het weefsel zijn gegaan, en door een elastische botsing zijn teruggekaatst
(= geen energie verloren)

Ze geven info over de atomische compositie van het staal:

grote atomen , zullen lichter kleuren omdat ze meer backscatter veroorzaken

Question 8

Hoe kan je in SEM met hogere voltages werken? Bespreek dit voor een weefsel , en voor specifieke onderdelen van het weefsel

Answer 8

Door ervoor te zorgen dat het weefsel zelf meer weerkaatst , door die te bedekken met een hoogatomische element: vb door gold coating (sputtering)

men kan ook specifieke structuren kleuren door immuno-gold labeling.

Question 9

Geef de nadelen van SEM en TEM.

Answer 9

• je werkt in vacum, en bestraalt me elektronen dus levende objecten zijn geen optie
• je kijkt naar zeer dunne coupes of gewoon opervlaktes

Question 10

Welke problemen hebben geleid tot de ontwikkeling van cryo TEM en cryo TEM tomography? Bespreek beide technieken.

Answer 10

met SEM en TEM kan men slechts dunne coupes bekijken. 3D beelden maken is geen optie.

Cryo-TEM:

> Door het staal in te cryogeen invriezen kan je die in zijn natieve vorm bewaren, en dus ook bekijken.

*enkel kleine biologische stalen mogelijk

Cryo TEM tomopgraphy:

Voor kleine stalen die cryogeen bevroren zijn >je kan het staal onder verschillende hoeken bekijken (zoals confocale) , en TEM stack maken . Vervolgens 3D beeld reconstrueren.

Question 11

Waarom is focused ion beam milling (FIB-SEM) ontwikkeld. Leg de werking ook uit.

Answer 11

Probleem:
cryo TEM tomografie is mogelijk voor kleine coupes.

FIB-SEM is een tomografische methode

Seriele sectionering door blockface methode: je snijdt coupes af, en neemt van wat achterblijft een SEM beeld

*hier gebruik je een hoog energetische galium laser ipv een scherpe mes omdat er anders grote artefacten worden geïntroduceerd

dit is een geautomatiseerde methode = snel

grootste nadeel: EM heeft een hoge resolutie (tt 1nm) , en dus staal is super dens. alle cellen en structuren moeten individueel gekleurd worden voor 3D beeld reconstructie.

Question 12

Welke probleem heeft geleid tot de ontiwkkeling van CLEM: Correlative light and electron microscopy

Answer 12

Probleem:
In EM werken we in vacuum, en hoog energetische elektronen worden gebruikt .Hierdoor is leven en behoud van structurele integriteit moeilijk.
-> geen zicht op dynamische processen

Hoe kan je dynamische structuren volgen met ultrastructuur achtergrond?

Door fluorescentie microscopie te gebruiken voor specifieke structuren herkend door labeling volgen in de tijd.

vervolgens deze te blokkeren en inbedden voor EM ,
kan men moleculen herkenne, in een untrastructuur achtergrond gecreerd door het EM beeld

Question 13

Geef een elektron interactie waarbij er geen energie wordt verloren

Answer 13

• een elektron kan zonder interactie doorlopen
• backscatter: het kan door elastische interactie, teruggekaatst worden richting waar het afgevuurd werd

-elastisch weerkaatste elektronen:
het kan door elastische interactie gebroken worden weg van de bron

Question 14

Bespreek elektron interacties waarbij er energie verloren gaat

Answer 14

• elektronen verliezen energie door interactie.

Bijgevolg kunnen er elektrotronen
uit het materiaal worden vrijgemaakt
> secundaire elektronen

(licht emissie, x-stralen emissie is ook mogelijk)

Question 15

Bespreek de ‘electron gun’, en waarom de elektronen versneld uitgestuurd worden.

Answer 15

De elektrongun is de kathode:
een ionisch filamentje, dat bij verhittin elektronen uitstuurt thv zijn puntjes.

cilinder rond het filamentje is negatief gelanden, en zorgt ervoor dat de elektronen gebundeld blijven.

Deze elektronen worden door de anode aangetrokken = versnelling, dus ze plakken niet op anode

Question 16

Wat is het verschil in de opstelling van een TEM, en een lichtmicroscoop?

Answer 16

• elektronenbron -> condensor -> staal -> objectief ->projectorlens -> detector

*de lenzen hier zijn echter sterk opgerolde solenoiden, die ahv een elektromagnetisch veld elektronen buigt.
(=> focale punt bepalen kan bepaald worden ahv het magnetisch veld)

• alles gebeurt in vacum, omdat elektronen reactief zijn
• detector is vaak CCD camera, maar gezien deze enkel fotonen kan detecteren, zal er een scintillator gebruikt worden, om de elektronen om te zetten in fotone,

opbouw licht microscoop:

Lichtbron-> condensor -> staal -> objectief -> oculair -> detector

Question 17

Wat zijn de nadelen van EM? Geef ook oplossingen

Answer 17

> bij TEM: elektronen interageren met omgeving, en geraken niet diep in de staal -> geen diepe coupes (<100 nm)

> behandeling om fixeren (formaldehyde bv) en dunne coupes maken (= grote vervorming, en artefacten )

oplossing:
cryo tem tomografie of FIB-SEM

Question 18

Wat is het nadeel bij het gebruik van fixatiemiddelen zoals formaldehyde in EM?

Answer 18

• vervorming

oplossing op fixatie probleem:
op vloeibare stikstof brengen en
vriesdrogen

(kristalvorming vermeden)

Question 19

Wat is het nadeel van CLEM: Correlative light and electron microscopy. Geef een oplossing

Answer 19

• Na overgang van lichtmicroscopie naar EM te gaan, moet je u kunnen orienteren.

De gebruikte fluorochromen in fluorescentie microscopie zullen bij de inbedding voor EM ook verloren gaan.

oplossing:

> bestendige fluorochromen
EM microscoop die fluorescentie detecteren
quantum dots zijn beide dens, en fluorescente merkers

Question 20

Hoe is de resolutie van SEM tov TEM?

Answer 20

SEM: 1-10 nm
TEM: 0.1 nm

Question 21

Wat kan je zeggen over het beeld van secundaire elektronen, en backscatter elektronen in SEM?

Answer 21

De secundaire elektronen geven een beeld over het relief

Backscatter elektronen geven een intensiteit verschil. Dense structuren met hoge atoomnummer, zullen meer backscatter elektronen hebben, waardoor deze intenser kleuren. Ze zorgen ook voor dieptezicht

Question 22

Kan je backscatter in SEM verhogen door voltage verhoging ? Zo ja, wat is het voordeel/nadeel?

Answer 22

Een hoge voltage zorgt voor:

voordeel:
-meer backscatter = meer diepte zicht

nadeel:

• verhoogde voltage leidt tot een interactie volume tussen weefsel en ingestuurde elektronen -> beeld wordt breder (= slechtere resolutie)
• backscatter elektronen kunnen indien te hoge energie, door weefsel terugkaatsen -> weefsel kleurt licht -> lage resolutie

Question 23

Bespreek preparaat voorbereiding bij EM

Answer 23

• elektronen verliezen snel hun energie -> dunne coupes nodig om hoge resolutie te bewaren
• Er kan geen levende staal in de EM (vacum, elektronen,..) . staal moet gefixeerd worden , omdat het dode weefsel is . Deze stap zorgt voor grote vervormingen in structuur
• bij het maken van dunne coupes, kunnen er scheuren en vervormingen optreden -> inbedden in hardere materiaal zoals hars
• Hars is hard, en moed dun gesneden worden -> diamante mes

coupes zijn heel dun, dus moeten ze worden opgevangen in een waterbad, zodat opp spanning ervoor zorgt dat het niet op zichzelf vouwt.

• een kopere grid wordt gebruikt om coupes op te vangen
• gezien de coupes heel dun zijn , zullen ze niet veel elektronen verstrooien. Daarom worden er zware metalen toegevoegd aan staal, voor meer contrast (je kan hier ook selectief kleuren)