Hst 4: Deep coverage Flashcards
Wat is deep coverage microscopie?
-> met deep coverage krijg je info over spatiotemporale gedragingen van cellen in respons op toedienen van genetische veranderingen , of drugs
hoe?
-> heel veel beelden schieten onder verschillende condities (multiplex sample preparation)
- > beeld informatica software om beelden te interpreteren
doel: storingen in de cel opsporen (genetisch (knock out/downs, overexpressie..) , of farmaceutisch (toxiciteit, carcinogeniciteit, bescherming,..))
Bespreek data size dimensionality in deep coverage microscopy
- well platen automatisch één per één screenen
-binnen in elke wel andere regios in kaart brengen
(in 3D of in 2D)
- combinatie van verschillende kanalen gebruiken (vb kanaal voor fluorescentie licht, een kanaal voor gewone licht?)
- beelden in de tijd opnemen
Beschrijf hoe ‘painting cells’ kan aantonen hoe bepaalde drugs de fenotype van de cel veranderen. Geef ook een nadeel
cellen verliezen snel hun morfologie, wanneer ze worden blootgesteld aan ongunstige omgevingsfactoren.
kleurstoffen die verschillende cellulaire componenten kleuren, kunnen gebruikt worden om de anatomie van de cel bloot te stellen. Zo kan men onderzoeken hoe dat een drug het fenotype van de cel verandert
*nadeel spectrale overlap risco verhoogt
Wat is het probleem met ‘painting cells’ Hoe kan je dit oplossen?
er is spectrale overlap, dus er is bleedthrough in de siganeln die elke kanaal ontvangt.
Hierdoor is men genoodzaakt om een beperkt aantal fluorochromen te gebruiken.
Oplossing:
- quantum dots hebben een fijnere emissie spectrum. daarnaast worden ze allemaal tezamen geexciteerd.
- spectrale detector: detector die hele spectrum opneemt, zal gebruikt kunnen worden om te corrigeren voor spectrale overlap (spectral unmixing)
- gewoonlijk wordt een detector gebruikt die het emmisie dat door een filter is doorgelaten detecteert. hier is er geen filter, en heel het emissie spectrum wordt gedetecteerd
- lifetime decay pattern unmixing
Hoe werkt een spectrale detector?
De fluorochromen in een staal kunnen van elkaar gescheiden worden door een spectrale detector (elke fluorochroom heeft zijn eigen emisse spectrum.)
In het spectrale detector is er een object aanwezig (vb een prisma) die het emissielicht (die initieel dus een mix is van emissie licht golflengtes van verschillende fluorochroen) dat inkomt in zijn componenten scheidt. dit doe je voor elke pixel
hierdoor heb je een 3D beeld = hypercupe ontstaat, met als 3de dimensie de golflengte
Bespreek spectral unmixing: deconvolutie. geef ook een voorbeeld
Danzij de spectrale informatie gecapteerd door de spectrale detector kan men mathematisch individuele fluorochroom uithalen. Dit kan door het spectrum van elke fluorochroom apart te kennen, en het overlappende stuk met een 2de fluorochroom weg te rekenen
vb: in kayotypering kunnen chromosoom specifieke pobes worden gebruikt om translocaties bloot te stellen
Wat is RGB marking: red green blue marking
- je hebt maar rood,groen en blauw, nodig om alle kleuren te vormen.
- Een methode om cellen individueel te kleuren
hoe?
door virale vectoren te gebruiken die elks rood, geel of groen zijn en cellen te besmetten. Besmetting verloopt stochastisch, en elke cel zal een specifieke kleur krijgen . zo kan je ook zien welke cellen van dezelfde oercel komt (handig voor kanker)
Wat zijn de nadelen van RGB marking?
- besmetting verloopt stochastisch
- je kleurt niet specifiek -> geen info over moleculaire componenten van de cel
Welke probleem heeft geleid tot het ontstaan van cyclic staining (toponomics of ook multi-epitope cartography)
probleem:
bij het gebruik van RGB marking, zal :
- besmetting stochastisch verlopen
-je kleurt aspecifiek -> geen info over moleculaire componenten van de cel
Oplossing:
- kleur staal met 1 of 2 merkers , en neem een foto van wat gekleur is.
-was het eraf/bleek ze, en breng dezelfde merkers opnieuw aan om andere componenten te kleuren
(je gebruikt pseudokleuren voor de verschillende stappen)
(antilichamen kunnen specifiek binden)
Welke twee methodes kan je gebruiken om unmixing toe te passen?
- life time unmixing: elke fluorochroom heeft zijn eigen lifetime
- opgelet: afhankelijk van omgevingsfactoren
- spectrale unmixing
*in beide gevallen moet je eerst kennis opdoen van wat de individuele lifetime/spectra zijn
Bespreek kernen als uitgangspunt voor beeldinformatica
kernen dienen vaak als uitgangspunt : ze hebben een typische vorm, en ze zitten ver van elkaar.
zo kunnen cellen, organellen,.. herkend worden
(vb : door het genoom te kleuren kan je celdeling volgen in elke locatie in een staal met veel cellen
vb: je kan de vorm en opp van kernen zien )
Hoe kan je lokale context gebruiken om betrouwbaardere metingen te doen? Geef voorbeelden
op cel niveau kijken, zorgt voor een grote informatie inhoud (organellen, ..)
door te kijken naar hoeveel cellen er rond een cel zitten, heb je informatie over de micro omgeving van de cel .
De lokale context van cellen is belangrijk:
vb: in sommige gevallen is virale besmetting is afhankelijk van de locatie van de cel (vb: buitenste cellen vs binnenste cellen in een micro-omgeving
vb: celcrowing zorgt ervoor dat het volgen van de cellen moeilijker wordt. Als je weet hoe dens uw staal is , kan je ervoor corrigeren)
bespreek hoe je de enorme toevoer van info kunt verwerken in deep coverage microscopy. Bespreek data mining
- informatie kanaliseren: voor elke kenmerk (vb: celtype, grootte, intensiteit) vergelijken met een controlegroep zodat je weet of het een toename/afname is
(je kan dit ook vergemakkelijken door categorieën (vb: info over de vorm van de cel samenbundelen) van kenmerken die samen horen te maken, zodat het sneller verloopt)
Bespreek het verschil tussen screening en profiling
Deep coverage microscopie wordt gebruikt om veranderingen in de cel op te sporen, door genetische veranderingen, of door farmaca.
screening: je weet wat je zoekt, en je wilt weten wat het effect is van genetische/ farmaceutische veranderingen vb: topic is celdood
profilign: je wilt weten welke effecten er zijn in bepaalde celpopulaties bij het induceren van genetische of farmaceutische veranderingen, en of er nieuwe, ongewenste effecten zijn in deze cellen (vb: een gen uitschakelen, en zien wat de effecten zijn op de cel)
* je kan bv drugs /genen categoriseren ahv hun profile
(in de toekomst kan je dan genen/drugs die gelijkaardige werkingen hebben als wat je al hebt geprofiled, er vanuit gaan dat ze ook andere kenmerken delen met die categorie)
Geef een vb van hoe profiling kan gebruikt worden bij kanker onderzoek
-cellijnen waar specifieke genen zijn uitgeschakeld blootstellen aan kanker medicatie . De uitgeschakelde genen zijn specifiek aan kanker (geven kanker een voordeel) -> dit als achilleshiel gebruiken, om farmaca gebruiken die deze cellen targetten
