Hst 6: Deep tissue imaging Flashcards
Waarom is een dikke coupe weefsel opaque (geef 2 oorzaken)? Bespreek wat de problemen met zich meebrengen. Welke golflengte kan je gebruiken, zodat het dieper geraakt?
Geef de verhouding tussen breking, en de gebruikte golflengte
*Enkel Beeld qualiteit tot 20 nm na de opp is duidelijk zichtbaar.
dikke coupes hebben macromoleculen die licht absorberen/verstrooien
Absorbtie:
*near infrarood heeft het minste absorptie.
Verstrooiing:
hoe dieper de golven moeten reizen, hoe meer verstrooiing er optreedt.
*licht van een korte golflengte is gevoeliger aan verstrooiing
(verstrooiing (i) = 1/lamda^4
dus weer: rood verschoven licht is beter
bestendig tegen verstrooiing)
Problemen met verstrooiing:
- licht bereikt het focusvlak niet omdat het door breking verloren gaat
- verstrooide emissie licht
- > licht valt buiten de NA van de lens , en wordt niet gedetecteerd
- >licht buiten het focusvlak komt in de NA van de lens
Bespreek Seriale coupering als deep tissue imaging methode.
Geef de voor en nadelen
uw staal in coupes snijden, en apart in beeld brengen.
Vervolgens deze samenbrengen.
voordelen:
3D beeld
Nadelen:
- > destructief
- > arbeidsintensief
- > veel artefacten (scheurtjes, vervormingen,..)
Bespreek blockface als deep tissue imaging methode.
Geef de voor en nadelen
weefsel monteren voor objectief, en beeld nemen, vervolgens coupe snijden.
Voordelen
->minder artefacten (wat je tezien krijgt , is niet veel behandeld )
Nadelen:
- > destructief
- > moeilijke opstelling
Bespreek multifoton microscopie.Welke probleem heeft geleid tot de ontwikkeling:
Geef de voor en nadelen van NIR licht gebruiken.
nabij infrarood licht is minder vatbaar voor absorptie en verstrooiing
- > kan dieper gaan
- > kan voor invivo beeldvorming gebruikt worden
probleem:
-> kan niet veel fluorochromen exciteren (want deze worden geexciteert door golflengtes van zichtbaar licht)
oplossing:
multifoton micoscopie
excitatie/emissie
Om dezelfde energie over te brengen als langere golflengtes , wordt NIR licht snel achter elkaar gezonden (zo brengen ze hun energie snel achter elkaar in)
*deze snelheid is enkel mogelijk, als deze compact wordt ingestuurd
Bespreek temporal en spaciale compression in multifoton microscopie.
(zie slide 3, p 4)
Temporele compressie:
een methode om fotonen met een hogere golflengte , snel achter elkaar uit te sturen in de tijd
(dit is geen continue laser. In een gewone (continue) laser komen de fotonen random , niet gecomprimeerd voorkomen.
Reden: je wilt uw fluorochromen niet fotobleken. 10 ns tussen laten om hen terug tot grond toestand te brengen.
Deze laser is niet continu omdat de fotonen gecondenseerd zitten.
https://www.youtube.com/watch?v=ckBMlVoAYeY&ab_channel=AnimatedbiologyWitharpan
Spatiale compressie
Door de laser, juist bij de focusvlak to comprimeren, kan men ervoor zorgen dat enkel de fluorochromen van de focus vlak worden geexciteerd -> de rest van de coupe ontvangt geen energierijke bundel, dus raakt niet geëxciteerd.
netto voordeel: > geen nood meer aan een pinhole waarom? * het emissielicht van uit de focusvlak zal nog steeds verstrooid worden. Een pinhole zou dus licht vanuit het focusvlak tegenhouden als het aanwezig was ( je werkt inherent confocaal)
> minder fotoschade , omdat je heel specifieke regios belicht
Vergelijk confocale microscopie met multifoton microscopie in functionaliteit.
bij multifoton microscopie, kan men enkel het focusvlak exciteren -> specifiekere signaal -> geen nood aan pinhole, want inherent confocaal
bij confocal microscopie is dit niet mogelijk -> aspecifieke signaal -> nood aan een pinhole
Bespreek photo uncaging
Men kan bepaalde moleculen modifieren ,zodat ze in een ‘cage’ zitten. De cage wordt geopend, wanneer men er licht op straalt
met multifoton microscopie. Men kan specifiek de target moleculen in het weefsel activeren = functionele imaging
gezien de laser in multifoton microscopie heel specifieke focusvlakken kan bestralen, zal je 3D regios kunnen afzonderen en de activiteit van de molecule bestuderen
vb: chemisch gemodificeerde glutamaat in neuronen volgen
Kan je met multifoton microscopie goede beeld krijgen op de structuur van organen?
Nee, multifoton microscopie kan tot 1 mm diep .
Verder is niet mogeiljk (nogsteeds) door scattering, en absorbtie .
Om dit wél te kunnen doen, kunnen we het staal zelf transparant maken.
*With just about any confocal scope, images can be obtained 1–2 mm into tissue that has been cleared with Visikol HISTO. “You need two-photon or lightsheet fluorescence microscopy and water [immersion] objectives to go deeper than 4 millimeters,” he says.
Hoe maak je weefsels transparant ? Bespreek Clearing, en waarvoor het is uitgevonden. Bespreek ook de nadelen.
Clearing is uitgevonden om hele organen doorzichtig te maken.
2 concepten aan de basis van clearing :
- lipiden verwijderen
- brekingsindex van wat overblijft matchen door een vloeistof waarin het weefsel wordt gedoopt (vr eiwit)
*hoe dieper dat je gaat, zal je terug last hebben van breking en absorbtie
nadeel:
>duurt heel lang
> detergenten en zouten gebruikt tijdens de procedure laat het weefsel vervormen (in verhouding, zwellen/krimpen)
Bespreek hoe je zwelling/krimpen van weefsel tijdens de clearing behandeling in uw voordeel kunt gebruiken
- krimpen: grotere structuren kunnen sneller in kaart worden gebracht
- zwelling: structuur is beter te bestudueren als het zwelt , want alles staat verder van elkaar ( = grotere resolutie)
Bespreek lightsheet microscopie ,en waarom is het ontstaan.
wat is het voordeel?
Waarom ontstaan?
>confocale microscopie is traag
-lightsheet microscopie: optische sectionering
Belichting is loodrecht op detectie: er wordt een licht ‘sheet’ door het staal gestuurd, en een coupe wordt genomen van een volledige vlak = widefield detectie + je belicht enkel wat je wilt zien = confocaal
Voordelen:
>levende stalen (als ze doorzichtig zijn bv: zeepaardjes)
= GROTE stalen in beeld brengen
> je werkt zoals een wide field omdat je heel uw staal meteen belicht (= wide field perks. confocaal doet punt per punt)
= sneller
> je belicht met de light sheet enkel wat je wilt zien ( = zoals confocaal)
= minder fotoschade
wat zijn de tekortkomingen van lightsheet microscopy?
- licht zal nooit perfect als een sheet door het staal gaan: licht spreidt altijd uit door breking en absorptie
- > beeld wordt waziger hoe dieper je gaat (erger als staal dens is)
-streep artefacten ontstaan door structuren aan de randen die het licht tegenhouden, en het licht verstrooien
oplossing: staal van links en rechts belichten
en het platform waar de staal op sit roteren (opnames van verschillende hoeken)
Tot hoeveel mm kan multifoton microscopie gebruikt worden?
tot 1 mm diep. Je kan dieper gaan door weefsel clearing, want men kan niet dieper kijken door breking, en absorbtie.
*na clearing, kan je gwn confocale microscopie gebruiken
With just about any confocal scope, images can be obtained 1–2 mm into tissue that has been cleared with Visikol HISTO. “You need two-photon or lightsheet fluorescence microscopy and water [immersion] objectives to go deeper than 4 millimeters,” he says.
Waarom laat je bij de puls laser van de multifoton microscoop (spatiale compressie) 10 ns ruimte tussen de pulsen?
Je geeft de flurochromen de tijd om terug te vallen, voor ze opnieuw worden geexciteerd. Anders is er fotobleking
Tot hoe diep kan een confocale microscoop beeld geven. Vergelijk dit met multifoton microscopie.
500 micrometer. Multifoton kan tot 1-2 mm (na klaring, kan confocale tot 1-2 mm, en multifoton tot voorbij 4nm)
