Hst 3: Dynamics Flashcards
Welke probleem zorgde ervoor dat fotoblekingstechnieken werden uitgevonden
in lichtmicroscopie is het resolverende vermogen 200 nm (typische moleculen zijn ong 1-10 nm groot)
dit is ver boven de afmetingen van moleculen in de cel
om dynamiek en interacties van deze moleculen te volgen
Hoe visualiseer je levende organismes. Waar moet er een balans gevonden worden
Er is een balans tussen 4 componenten:
-temporele resolutie
-contrast
-spatiale resolutie
-viabiliteit
wanneer één van deze verhogen, zullen de andere verslechteren
Bespreek de afweging tussen contrast en resolutie
Contrast:
meer contrast ,gaat gepaard met meer belichting en grotere regios die je in beeld wilt brengen -> lagere resolutie
temporele en spaiale resolutie:
contrast transfer functie : hoge spatiale resolutie gaat gepaard met lagere contrast
Bespreek de afweging tussen contrast en de snelheid waarmee de camera capteert.
Wat doe je als je het contrast wilt verbeteren bij een hoge temporele resolutie?
Temporele resolutie:
als je snelle opnames maakt, zal je minder licht capteren met de camera.
Contrast:
hierdoor zal je minder contrast hebben.
(contrast gaat hand in hand met signaal: aantal fotonen x QE x opname tijd)
Spatiale resolutie:
wil je dan toch uw contrast behouden, dan zal je uw spatialeresolultie moeten verslechteren (beeld met weinig pixels = slechte resolutie)
Bespreek belichting en viabiliteit
Er is fotoschade door
foto bleking: fluorochromen gaan irreversibel kapot. Dit is door overgang in de triplet state, en elektron vervalt op een tragere manier -> reageert weg met omgevingsmoleculen = ROS .
foto toxiciteit :
ROS is schadelijk voor de cel zelf
dus 2 aspecten aan fotoschade:
- Foto bleking
- Foto toxiciteit
Geef de afweging onderwerpen
- temporele resolutie
- spatiale resolutie
- contrast
- viabiliteit
Hoe verbeter je de viabiliteit van de cellen, bij intense belichting?
ROS aanpakken:
-antioxidanten medium (ascorbine, retionoide,..)
- geen zuurstof
- afhanklijk van celtype (vb: kanker kan tegen zuurstof arme omgeving)
-belichting verminderen in ruimte: bepaalde regios belichting ipv alles
- belichting verminderen in tijd: korte opnames of minder opnames
(vb: mitose volgen -> duurt ong 30 min, dus bv om de 15 min opnemen)
Hoe kan je fotobleking in uw voordeel gebruiken
een cel die GFP tot expressie brengt, zal gfp eiwit in heel de cel hebben.
het GFP eiwit kan met specifieke eiwitten tot expressie laten gebracht worden, zodat met de mobiliteit van het eiwit kan volgen
Bespreek FRAP: fluorescence recovery after photobleaching
teken curves (p5, slide 2)
hoge intensiteit belichting op een regio -> fotobleking -> geen fluorescentie
alles is dynamisch door diffusie, dus indien er geen barriere is, of als de eiwitten gebonden zijn (= immobiele fractie) , zullen de gebleekte moleculen richting de gebleekte regio gaan = herstel van fluorescentie
= mobile fractie herstelt de fluorescentie
*er is ook een algemene intensiteit daling
hierna, mbv formules:
-info over de snelheid , mobiliteit, en grootte van de moleculen (vb: histonen met GFP labelen: na frap, zal er geen recovery zijn van beeld, want histonen zitten vast aan DNA)
Bespreek FLIP: fluorescence loss in photobleaching .
teken de curve (p6, slide 2)
- een zelfde regio blijven bleken, tot alle fluorescentie signaal vervalt.
dit geeft beeld over hoe verbonden regios zijn (vb: kern bleken, en cytoplasma loopt leeg = verbonden)
Welke probleem heeft geleid tot de ontwikkeling van FLAP: fluorescence localisation after photobleaching?
wanneer een frap en flip experiment gedaan werden, waren de gebleekte fluorochromen voor goed verloren.
In FLAP maak men gebruik van 2 fluorescente moleculen, die op dezelfde eiwit zijn geïncorporeerd:
door een golflengte te gebruiken die het ene exciteert, zonder dat de andere . Zo zie je een regio die vb rood is, en wegdiffundeert
Geef een alternatief voor FLAP: Bespreek foto activatie
Bij foto activatie gebruikt men een fluorescente eiwit, die sterk fluoresceert wanneer het bestraald wordt met een specifieke golflengte. Zo kan het gevolgd worden wanneer het diffundeert/niet diffundeert.
- je kan de cel niet zien , tot dat je die regio bestraalt, want er is geen fluorescentie tot dan
vb: fotoactiveerbare GFP is een molecule die initieel heel zwak fluorisceert bij zijn excitatie licht (488nm), wanneer je het activeert met een lichtpuls van een andere golflengte, zal die sterk fluoresceren bij zijn eigen golflengte (488nm). Dit is door een conformatie verandering
Geef een alternatief voor foto activatie: bespreek fotoconversie
door een fluorochroom te gebruiken die initieel al een kleur heeft (= cel is zichtbaar) en bij bestraling een andere kleur uitzendt, zal men de diffusie kunnen volgen met referentie dankzij de kleur die initieel aanwezig was
Wat is het voordeel van van fotoconversie vergeleken met flip, flap en frap?
Je moet niet meer fotobleken = verbeterde viabiliteit
maar je hebt alle voordelen van fotobleken
Bespreek de lifetime van fluorochromen
het terugvallen van een fluorochroom is heel snel,
maar het vervallen van fluorescentie licht van meerdere fluorochromen kan in lifetime worden uitgedrukt
lifetime = de halfwaarde tijd van fluorescentie verval (hangt af van waar in de cel, vb lysosoom , door hoge pH = snellere verval)
*door de fase verschuiving en amplitude verschil in het emissie licht , kan men de halfwaarde tijd bepalen
Hoe kan je moleculaire interacties in de cel volgen? Bespreek FRET: Förster resonance transfer. Teken het jablonski diagram
Door het energie (!!) te gebruiken, om een andere fluorochroom te exciteren (MITS ze dicht genoeg zitten bij elkaar, voor interactie), zal men emissie licht van de 2de fluorochroom kunnen meten/
*opgelet: er is non-radiationele transfer van energie tussen donor en acceptor . Het is dus niet door het emissie licht van de donor
Wat zijn de voorwaardes om FRET te kunnen gebruiken
- spectrale overlap: energie van donor moet voldoende zijn om acceptor te exciteren.
- de fluorochromen moeten dichter dan 10 nm naast elkaar gelegen zijn
- de fluorochromen moeten juist georiënteerd zijn
Bespreek hoe bleedthrough FRET kan bemoeilijken .
Probleem:
fret is nooit 100% efficient: er zal fluorescentie optreden van beide donor , én acceptor na excitatie van de donor (geen 100% transfer, Wél is het een verzwakte fluorescentie .)
–>er is signaal van donor in kanaal van acceptor , door spectrale overlap
Fret heeft door spectrale overlap, bleedthrough.
- Hoe kan je bevestigen dat het signaal van de acceptor niet van de donor komt?
- hoe kan je de efficientie van de energie transfer kwantiefieren
(Bespreek acceptor Photobleaching)
Een bevestiging voor dat er inderdaad fret plaatsvond is door de acceptor te photobleachen, en controleren of het signaal van de donor krachtiger wordt.
daarnaast, door de donor emissie voor en na te vergelijken, kan de efficientie van de transfer berekend worden
extra:
One of the techniques for measuring FRET is acceptor photobleaching: the increase in donor fluorescence after complete acceptor photobleaching is a measure of the FRET efficiency.
Bespreek FLIM, een förster resonance transfer readout modes: Fluorescence lifetime imaging
FLIM is een methode, die bij fret wordt toegepast, om te controleren wat de efficientie van energie transfer is tussen donor en acceptor.
De lifetime van de donor is veel korter wanneer het energie doorgeeft aan de acceptor .
De snelheid waarmee dit gebeurt afhankelijk van hoe dicht donor en acceptor bij elkaar zitten.
Bespreek readout methodes voor FRET
- sensitised emission : acceptor fluorescentie wanneer donor belichten
- acceptor photobleaching
- FILM :bekijk levensduur van donor
Bespreek hoe een intramoleculaire fret paar werkt. Wat is het verschil met een intermoleculaire paar?
Moleculen die donor én acceptor bevatten, zullen bij bepaalde activiteiten, een conformationele verandering ondergaan , zodat de donor en acceptor dichter bij elkaar komen te zitten
(vb: Calmoduline ondergaat een conformationele verandering bij aanwezigheid van calcium. Door donor én acceptor op calmoduline te koppelen, kan je volgen wanneer calcium aanwezig is)
Intermoleculaire fret paar:
om te zien of proteine A interageert met proteine B, kan je op proteine A de donor/ acceptor koppelen, en aan proteine B wat overblijft
Welke probleem heeft geleid tot de ontwikkeling van BIFC bimolecular fluorescence complementation
- fret is duur
- je zit met donor én acceptor signalen (dus er is signaal wanneer er geen en wél interactie is)
één fluorescente eiwit in twee knippen, en hechten aan 2 eiwitten. wanneer proteine A en B met elkaar interageren, zal het fluorochroom 1 complex vormen, en is er signaal. Dus, er is
geen signaal als er geen interactie is
Bespreek FCS: fluorescentie correlation spectroscopy
tot welke categorie van microscopie technieken behoort het?
FCS behoort tot de categorie van fluctuation microscopy
Confocale microscopie belicht een kleine volume van het staal
je kan dit gebruiken om kleine regios met enkele moleculen te belichten:
je parkeert uw laser. Vervolgens, gezien moleculen bewegen , zal je fluorescentie signalen opmeten van de moleculen die toevallig in het laser licht terechtkomen .
hieruit kan je de snelheid en grootte van de moleculen berekenen.
*afhankelijk van:
> de temperatuur
> de densiteit van de omgeving waar diffusie moet plaatsvinden (viscositeit )
> de grootte van de molecule
Men krijgt dus info
>over de grootte
> over de interactie van molecule
zie p 14 slide 3
(vb: een eiwit die normaal een bepaalde autocorrelatie curve heeft (info over diffusie kinetiek) , bij interactie met een andere molecule, zal een grotere complex gevormd worden, die een andere autocorrelatie curve heeft . Uit de curve kan je zien hoeveel van het eiwit een complex heeft gevormd)
