Hst 3: Dynamics Flashcards
Welke probleem zorgde ervoor dat fotoblekingstechnieken werden uitgevonden
in lichtmicroscopie is het resolverende vermogen 200 nm (typische moleculen zijn ong 1-10 nm groot)
dit is ver boven de afmetingen van moleculen in de cel
om dynamiek en interacties van deze moleculen te volgen
Hoe visualiseer je levende organismes. Waar moet er een balans gevonden worden
Er is een balans tussen 4 componenten:
-temporele resolutie
-contrast
-spatiale resolutie
-viabiliteit
wanneer één van deze verhogen, zullen de andere verslechteren
Bespreek de afweging tussen contrast en resolutie
Contrast:
meer contrast ,gaat gepaard met meer belichting en grotere regios die je in beeld wilt brengen -> lagere resolutie
temporele en spaiale resolutie:
contrast transfer functie : hoge spatiale resolutie gaat gepaard met lagere contrast
Bespreek de afweging tussen contrast en de snelheid waarmee de camera capteert.
Wat doe je als je het contrast wilt verbeteren bij een hoge temporele resolutie?
Temporele resolutie:
als je snelle opnames maakt, zal je minder licht capteren met de camera.
Contrast:
hierdoor zal je minder contrast hebben.
(contrast gaat hand in hand met signaal: aantal fotonen x QE x opname tijd)
Spatiale resolutie:
wil je dan toch uw contrast behouden, dan zal je uw spatialeresolultie moeten verslechteren (beeld met weinig pixels = slechte resolutie)
Bespreek belichting en viabiliteit
Er is fotoschade door
foto bleking: fluorochromen gaan irreversibel kapot. Dit is door overgang in de triplet state, en elektron vervalt op een tragere manier -> reageert weg met omgevingsmoleculen = ROS .
foto toxiciteit :
ROS is schadelijk voor de cel zelf
dus 2 aspecten aan fotoschade:
- Foto bleking
- Foto toxiciteit
Geef de afweging onderwerpen
- temporele resolutie
- spatiale resolutie
- contrast
- viabiliteit
Hoe verbeter je de viabiliteit van de cellen, bij intense belichting?
ROS aanpakken:
-antioxidanten medium (ascorbine, retionoide,..)
- geen zuurstof
- afhanklijk van celtype (vb: kanker kan tegen zuurstof arme omgeving)
-belichting verminderen in ruimte: bepaalde regios belichting ipv alles
- belichting verminderen in tijd: korte opnames of minder opnames
(vb: mitose volgen -> duurt ong 30 min, dus bv om de 15 min opnemen)
Hoe kan je fotobleking in uw voordeel gebruiken
een cel die GFP tot expressie brengt, zal gfp eiwit in heel de cel hebben.
het GFP eiwit kan met specifieke eiwitten tot expressie laten gebracht worden, zodat met de mobiliteit van het eiwit kan volgen
Bespreek FRAP: fluorescence recovery after photobleaching
teken curves (p5, slide 2)
hoge intensiteit belichting op een regio -> fotobleking -> geen fluorescentie
alles is dynamisch door diffusie, dus indien er geen barriere is, of als de eiwitten gebonden zijn (= immobiele fractie) , zullen de gebleekte moleculen richting de gebleekte regio gaan = herstel van fluorescentie
= mobile fractie herstelt de fluorescentie
*er is ook een algemene intensiteit daling
hierna, mbv formules:
-info over de snelheid , mobiliteit, en grootte van de moleculen (vb: histonen met GFP labelen: na frap, zal er geen recovery zijn van beeld, want histonen zitten vast aan DNA)
Bespreek FLIP: fluorescence loss in photobleaching .
teken de curve (p6, slide 2)
- een zelfde regio blijven bleken, tot alle fluorescentie signaal vervalt.
dit geeft beeld over hoe verbonden regios zijn (vb: kern bleken, en cytoplasma loopt leeg = verbonden)
Welke probleem heeft geleid tot de ontwikkeling van FLAP: fluorescence localisation after photobleaching?
wanneer een frap en flip experiment gedaan werden, waren de gebleekte fluorochromen voor goed verloren.
In FLAP maak men gebruik van 2 fluorescente moleculen, die op dezelfde eiwit zijn geïncorporeerd:
door een golflengte te gebruiken die het ene exciteert, zonder dat de andere . Zo zie je een regio die vb rood is, en wegdiffundeert
Geef een alternatief voor FLAP: Bespreek foto activatie
Bij foto activatie gebruikt men een fluorescente eiwit, die sterk fluoresceert wanneer het bestraald wordt met een specifieke golflengte. Zo kan het gevolgd worden wanneer het diffundeert/niet diffundeert.
- je kan de cel niet zien , tot dat je die regio bestraalt, want er is geen fluorescentie tot dan
vb: fotoactiveerbare GFP is een molecule die initieel heel zwak fluorisceert bij zijn excitatie licht (488nm), wanneer je het activeert met een lichtpuls van een andere golflengte, zal die sterk fluoresceren bij zijn eigen golflengte (488nm). Dit is door een conformatie verandering
Geef een alternatief voor foto activatie: bespreek fotoconversie
door een fluorochroom te gebruiken die initieel al een kleur heeft (= cel is zichtbaar) en bij bestraling een andere kleur uitzendt, zal men de diffusie kunnen volgen met referentie dankzij de kleur die initieel aanwezig was
Wat is het voordeel van van fotoconversie vergeleken met flip, flap en frap?
Je moet niet meer fotobleken = verbeterde viabiliteit
maar je hebt alle voordelen van fotobleken
Bespreek de lifetime van fluorochromen
het terugvallen van een fluorochroom is heel snel,
maar het vervallen van fluorescentie licht van meerdere fluorochromen kan in lifetime worden uitgedrukt
lifetime = de halfwaarde tijd van fluorescentie verval (hangt af van waar in de cel, vb lysosoom , door hoge pH = snellere verval)
*door de fase verschuiving en amplitude verschil in het emissie licht , kan men de halfwaarde tijd bepalen
