Hst 2: Fluorescentie basics Flashcards
Is er een directe correlatie tussen contrast en resolutie?
ja (snap uitleg niet)
Wat is het probleme met preparaten: bespreek fase objecten
Preparaten zijn vaak transparant :ze absorberen weinig licht (geen amplitude verandering).
Ze kunnen de golven echter wél vertragen (= fase verandering )
Gezien het oog enkel gevoelig is aan intensiteit en verschillen in kleur -> we zien niets van deze preparaten
Bespreek fase objecten
Fase preparaten:
vertragen/versnellen lichtgolven afhanklijk van het medium
Bespreek dark field microscopie
donker veld microscopie: welke probleem heeft de ontwikkeling van donkerveld microscopie getriggerd
Probleem:
- de mens ziet enkel amplitude verschilen
en gezien preparaten vaak weinig absorberen , is er geen amplitude verschil. Wél is er een fase verschil
Dark field microscopy:
door dit fase verschil om te zetten in amplitude verschil, kunnen we zicht hebben.
hoe?
gebruik een annulus , die centraal geen licht doorlaat, en aan de randen wél (ringvormige licht doorsturen naar condensor lens , zie p 15 slide 4)
->enkel gebroken licht visualiseren.
Dit kan door licht zo schuin in te sturen, dat het buiten de NA vallen.
Als het preparaat het licht afbreekt zal deze in de NA van het objectief vallen
Donkere achtergrond + beeld van het object
*dit werkt enkel op sterk brekende objecten
Bespreek fase contrast microscopie. Welke probleem heeft de ontwikkeling getriggerd?
teken opstelling p 16 slide 2
Probleem:
Dark field microscopie werkt alleen als het preparaat voldoende licht afbuigt.
Fase contrast microscopie
achter het objectief wordt een fase plaat gezet, waar centraal het licht door geraakt.
Als het licht gebroken wordt zal het niet door het centrum gaan, maar door de rand van deze plaat.
De randen zijn verdikt, waardoor het licht meer refractie ondergaat -> fase verandering
Licht vanuit de randen, zal nu interfereren met licht dat door het centrum is gegaan.
Zo kan er amplitude verschillen worden gemerkt
> lichte achtergrond, met het object
(licht omdat er wél licht in het NA vn objectief past )
lage golflengtes hebben … energie
hoge golflengtes hebben … lage energie
Hoge
Lage
Teken het jablonski diagram
S0, S1 rn S2 zijn discrete energie staten
Excitatie:
uit fluorochroom die geexciteerd raakt, zal een elektron uit zijn grondtoestand (S0) gaan, naar een aangeslagen toestand (S1 of S2)
Interne conversie:
Vervolgens verliest het heel snel kinetische energie, door interne conversie tot de basis van een aangeslagen toestand (vb S1)
Fluorescentie :
hierna zal het elektron nog meer energie verliezen in de vorm van fluorescentie , en vallen tot de grond toestand.
- het fluorescentie licht is van een grotere golflengte = verschuiving
- het kan ook zijn dat de elektron verder vervalt door verlies van kinetische/warmte energie tot grondtoestand ( = geen fluorescentie, maar ook geen elektron verloren)
Triplet state:
een elektron kan na interne conversie ook vervallen door fosforescentie . Bij deze is er een grote kans dat de elektron verloren gaat, door reactie met omgevingsmoleculen.
bespreek:
-interne conversie en stokes shift
-excitatie en extinction coefficient
-non radiatieve transfer (hitte, kinetische energie) ,
en fosforescentie en fluorescentie + quantum yield samen me omgevingsfactoren zoals pH
-brightness
Hoe lang duurt excitatie, en emissie?
excitatie is in fento seconde
emissie van fluorescentie gebeurt in nanoseconden
Bespreek de Stokes shift
geeft aan hoe sterk het energie verlies is tussen het excitatie en emissie licht.
Stokes shift = max excitatie golflengte - max emissie golflengte
*excitatie licht, en emissie licht zijn een spectrum
Bespreek de extinctie coefficient
= Licht absorberende capaciteit
The extinction coefficient is a measure of the quantity of absorbed light at a given wavelength. … Quantum yield is the number of emitted photons relative to the number of absorbed photons
de extinctie coefficient is afhankelijk van:
- de concentratie van de molecule
- grootte van het recipient
- zie formule lambert beer
Bespreek de quantum yield
efficiëntie waarmee de fluooschroon ingezonden licht kan uitstralen (= hoeveelheid uitgestuurde fotonen, op ingestuurde fotonen)
zaken die ervoor zorgen dat er elektronen vervallen, zonder fluorescentie uit te sturen
-warmte verlies en fosforescentie
Omgevingsfactoren zoals pH
Please note that quantum yield refers to events/photons emitted per events/photons absorbed while quantum efficiency refers to energy, i.e. energy out/energy in
Bespreek de triplet states
Triplet state:
Hier zal er na een non-radiatieve verval (vb hitte) , fosforescentie optreden.
fosforescentie : een toestand waarop een elektron langer kan gedijen (micro seconden).
Bespreek fosforescentie
Fosforescentie is een irreversibele toestand, waar een elektron verloren gaat na dat deze licht heeft uitgezonden.
Deze toestand is langdurend vergeleken met normale emissie (10-12 sec VS 10^6 sec)
Deze elektronen hebben de kans om te reageren met moleculen zoals zuurstof en water, waardoor ze verloren gaan
Geef het formule voor brightness en image brightness, en bespreek.
Brightness is de intensteit van licht dat door een fluorochroom uitgestraald wordt. Het kan berekend worden door de vermenigvuldiging van de absorbtie, en de quantum yield.
*omgeving bepaalt mee de helderheid, vb zuurtegraad
brightness = e x QY
image brightness is afhankelijk van de:
- numerieke apertuur (omdat wanneer het objectief meer licht opvangt het feller is)
- vergroting : hoe groter de vergroting, hoe minder licht wordt opgevangen
Image brightness = NA^4/M²
(NA heeft dus veel effect)
Bespreek epifluorescentie microscopie
Wit licht bestaat uit verschillende kleuren:
excitation filter: laat golflengte toe die de fluorochromen zal exciteren
Dichroische filter: laat specifieke emissie licht door :
>emissie licht bestaat initieel mogelijks uit emissielicht van meerdere fluorochromen
>er is mogelijks contaminatie met excitatie licht
>functie van emissie en excitatie filter is niet perfect
emissie filter: laat emissie golflengte door (extra zuivering)
*vb: short pass filter: korte golflengtes worden doorgelaten
long pass filter: langte golflengtes worden doorgelaten
bandpass: laat golflengtes tussen een specifieke marge door
Wat heeft geleid tot de ontwikkeling van het episcopische opstellingstechniek?
Probleem:
filters gebruikt voor het doorlaten van specifieke golflengtes zijn niet perfect.
want een diascopische opstelling, zal
Licht vanuit de omgeving (vb: het excitatie licht), door de emissie filter doorsijpelen
*gezien er ook veel licht nodig is om fluorochromen te exciteren, werkt dit dubbel tegen
Door de emissie filter uit het pad van de excitatie licht te halen, kan dit vermeden worden.
Hoe ? -> dichroische spiegel die specifieke golflengte weerkaatst, die de fluoroschromen exciteert.
Gezien het licht dat uitgestraald wordt van een langere golflengte is, wordt deze niet weerkaatst thv de dichroische spiegel
Bespreek de filter cube
een doosje in fluorescentie microscopie, waar
- excitatie filter
- emissie filter (houdt licht van ongewilde fluoroschroom emissie,overtollige reflectie van excitatie licht,.. tegen)
- dichroische spiegel
Wat is wide field microscopie int kort
het beeld wordt in een keer volledig opgevangen . Dit vormt een 2D beeld
(Een CCD camera , met pixelelementjes, vangt de fotonen op, en deze worden omgezet in foto elektronen)
Bespreek welke probleem heeft geleid tot confocale microscopie
wide field microscopie toont een 3D beeld, in 2D.
Confocale microscopie is een alternatief op een staal in stukken te moeten snijden (want dan is die dood)
Bespreek confocale microscopie
- punt per punt detectie zorgt voor diepte onderscheidend vermogen
- een pinhole, vlak voor de detector zorgt ervoor dat enkel ‘in focus’ licht wordt doorgelaten
(dit kan door licht van op het focus vlak in de pinhole te krijgen )
nadeel van pinhole : minder licht opgevangen
-> laser gebruiken
detector:
foto multiplier tube , die het signaal versterkt
Welke probleem zorgde voor het ontstaan van spinningdisk microscopie
Probleem:
confocale microscopie verloopt punt per punt, en is eerder traag. Dit zorgt ervoor dat snelle processen niet worden waargenomen
Oplossing: punt per punt scannen, van regios die ver genoeg van elkaar zitten = paralleliseren
nadelen:
- crosstalk bij dikkere stalen , door breking
- veel licht tegen gehouden door disk
Bespreek spinningdisk microscopie
- een schijf vol met gaatjes
- gaatjes dienen ook als puntbron
- schijf draait zodat je uiteindelijk een volledige beeld krijgt (denk aan die tram raamstickers met gaatjes)
probleem:
-> weer veel licht tegengehouden en dus intensiteit verlies
-> laserlicht moet gespreid worden over de schijf -> energie verlies.
- dikke stalen zullen licht breken, en zal er crosstalk zijn (licht komt in verkeerde pinhole terecht)
Crosstalk in dunne coupes kan tegengewerkt worden door een 2de schijf met lenzen.
Bespreek quantum dots
-organische kleurstoffen (kleine cadmium/selenium/zink) componenten
- grootte bepaalt emissie specturm ?
- nauwe emissie spectrum
- > minder spectrale overlap
nadeel:
-toxisch (hebben een schil nodig )
