Hst 5: superresolutie Flashcards
Geef enkele technieken die de resolutie verbeteren ondanks de diffractie limiet.
signal to noise ratio verhogen :
Hoe?
optica optimaliseren:
- technische problemen aanpakken: breking door staal, krassen en vuiltjes vermijden
-Deconvolutie
Er is interactie van diffractie licht en het object (licht dat op preparaat wordt beschenen) waardoor het beeld verslechtert door smudging
- > deconvolutie mathematisch compenseren ahv de pointspread function
- Confocale microscope
Wanneer een focusvlak wordt beschenene, zal je
uit focus licht uithalen door het licht door een pinhole te laten gaan. Dit verbetert de resolutie in x,y en z
*deconvolutie , en confocale microscopie brengen slechts kleine verbeteringen
EM golven bestaan uit twee componenten: nearfield en farfield
-Near field component benutten (evanescent light): Scanning near-field optical microscopy SNOM
dicht bij de bron, zeer kort (enkele nm) , veel kleinere golflengte -> hogere resolutie.
optie 1: staal dichtbij zetten
>Resolutie verhoogt, maar enkel opp structuren van de cel zijn zichtbaar
Optie 2: TIRF (total internal reflection)
een eigen nearfield veld creeren thv opp van cellen.
hoe?
Licht schuin insturen, zodat er reflectie optreedt = secundaire nearfield component
evenacent wave (nuttig voor resolutie verhoging) *er zal geen volledige reflectie zijn : ook energie verlies in de cel.
De evenacent wave dooft snel uit, en is hooguit 100 nm diep (= Z-as)
> je ziet opp structuren , en zaken nabij de opp
zo is er een verbeterde Z-resolutie
(andere assen onveranderd)
> achtergrond ruis wordt ook niet meegenomen (+)
Far field component verbeteren:
> 4pi belichting
2 lichtbronnen gebruiken om staal te belichten. De lichtbronnen aan weerszijde zetten (vb boven en onder)
de basis van interferentie : 2 golven zullen versterken of afbreken bij ontmoeting (afhankelijk van hun fase)
-> centraal heb je een scherpe lichtpunt door constructieve interferentie. Daarbuiten heb je vooral destructieve interferentie
= betere resolutie in Z-as resolutie omdat je meer de pointspread function fijner maakt, , en 2x de NA hebt (er zijn 2 objectieven)
*nadeel: moeilijke opstelling
> Structured illumination microscopy (SIM)
hoe maken we de X,Y assen scherper?
Gebaseerd op interferentie :als men 2 fijne patronen over elkaar zet, is er een nieuwe patroon met een slechtere resolutie.
= Deze is beter zichtbaar (ideaal voor zaken die te klein zijn om te zien)
Hoe wordt dit gedaan?
Een patroon over het object zetten, en roteren (zodat alle regios die in 1 hoek geblokkeerd werden door het patroon de kans krijgen om zichtbaar te worden) .
Vervolgens het beeld mathematisch reconstrueren
*probleem: je moet langer belichten om al deze opnames te maken
Geef het onderscheidend vermogen van een lichtmicroscoop
Het oog kan 2 punten onderscheiden die 1000 um (= 1 mm) van elkaar zitten ondershceiden.
Met een microscoop kan het 2 punten die 1 um van elkaar zitten onderscheiden
(fluorescentie licht : details tot 0.2 um (= 200 nm))
Waarom kan het onderscheidend vermogen van een lichtmicroscoop niet hoger zijn dan 200 um?
Het diffractie limiet
Wanneer golven door een opening moeten,zullen ze buigen. Dit veroorzaakt diffractie patroon, door een interferentie (airy patroon, met centraal het airy disk)
- lens foucuseert geen punt maar een diffractie patroon
Wat is de rayleigh limiet (rayleigh criterion)
wanneer men een doorsnede neemt van 2 airy patronen die heel dicht naast elkaar staan, zal de rayleigh limiet = aan de 25% intensiteit drop dussen de airy disks van deze airy patronen.
Het is een maat voor het onderscheidende vermogen van een apparaat.
wanneer de airy disks fijner worden, zal de resolutie ook verbeteren
Geef de resolutie formule van Ernst Abbe
Laterale resolutie:
Dx,y = 0.61 lamda/NA
*lage golflengte en
hoge NA = betere resolutie in x,y
Bespreek de resolutie in de Z-richting van de airy disk
Axiale resolutie:
dz= 2 x lambda/NA²
Rule of thumb: De resolutie in de Z-as is altijd 2-3 keer slechter vergeleken met die van de x,y as (meer uitgesmeerde airy disk).
In 3D (x,y en z richting) geeft een rugby bal vorm.
Bespreek de point spread function
De point spread function is een functie die zegt hoe een uiterst klein lichtpunt wordt uitgespreid in 3D
= weergave van de 3D resolutie van een microscoop
hoe bereken je de point spread function?
Resolutie in x y en Z berekenen
Dx,y= 0.61lamda/NA
Dz = 2lambda/NA²
Bespreek deconvolutie
https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/digitalimaging/deconvolution/deconintro/
- het beeld verslechtert door de smudging van de airypatroon. Dit is door de interactie tussen het object, en het lichtbron
= convolutie
-> Deconvolutie is het mathematisch compenseren ahv de pointspread function
hoe bereken je de point spread function?
Resolutie in x y en Z berekenen
(Dz = 2lambda/NA²)
Bespreek Far-field
Licht is een elektromagnetische golf, opgebouwd uit 2 componenten: far field en near field
-far field:
= typische fluorescentie golven die we gebruiken
> gaat tot een langere afstand en ondergaat interferentie en diffractie
> is onderhevig aan het abbe limiet
Hoe heeft men superresolutie kunnen bereiken (= abbes limiet overwonnen)
Geef ook een nadeel
Door fluoroforen efficiënter te gebruiken:
-PSF engineering (point spread function engineering)
> stimulated emission depletion (STED)
fluoroforen exciteren, en de fluoroforen die aan de buitenkant zitten terugdringen met een STED laser, nét voor ze fluorisceren
(rood verschoven licht nodig!)
STED laser is donutvormig dankzij een fase masker. Deze is ook onderhevig aan diffractie, waardoor de donut niet goed vormt . Oplossing -> zéér hoge intensiteit gebruiken
*zie formule S.Hell
nadeel -> overbelichting
-pointillism (wiskunde)
centrum van fluorochroom airydisk kan bepaald worden
(je bent niet 100% zeker of je het centrum bepaalt)
Hoe?
Single molecule localization (STORM/PALM)
Single molecule localization
> zwak belichten, zodat je slechts enkele fluorochromen per keer activeert, en regelmatig belichten tot beeld vol is met airydisks = pointillisme
vervolgens centrum bepalen ahv de gausiaanse profiel
Er zijn veel berekeningen betrokken , dus risico op artefacten is hoog
- nadeel, je kan het niet te vaak doen, anders bleking
nadeel: fluorophore (vb gelabelde antilichamen) hebben hun eigen afmeting -> we zien de target structuren + de probes .
(je moet uw label goed kiezen)
Wat is abbes limiet
An ideal optical system would image a point, perfectly as a point.
However, due to the wave nature of radiation, diffraction occurs , caused by the limiting edges of the system’s aperture stop (randen van de opening). The result is that the image of a point is a blur, no matter how well the lens is corrected.
Abbe recognised that specimen images are composed of a multitude of overlapping, multi-intensity, diffraction-limited points (or Airy Discs).
Geef de formule van S. Hell. Deze zegt dat de resolutie in theorie, tot oneindig kan verbeteren. Klopt dit ook in praktijk?
d= golflengte van het gebruikte licht/ 2 NA (1+ intensiteit/saturatie intensiteit)^1/2
Je moet de intensiteit van de STED (donut) laser kiezen, zodat het boven de saturatie intensiteit zit. Bij deze is er voldoende intensiteit om de moleculen terug te dringen.
hoe hoger de intensiteit, hoe beter de resolutie. In theorie zou je dus de intensiteit kunnen blijven verhogen , om een betere resolutie te hebben.
in praktijk zal de resolutie niet tot oneindig kunnen verbeteren door :
- optica limieten
- achtergrond signaal
- ..
enkel tot 30 nm is
mogelijk ( veel beter dan confocale die 230 nm haalt)
When optimally used, confocal microscopes may reach resolutions of 180 nm laterally and 500 nm axially,
Confocal imaging: 0-1000 µm beneath specimen surface
Bespreek stimulated emission depletion
https: //www.youtube.com/watch?v=1pgpzHao1c0&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https: //www.youtube.com/watch?v=YyBGiZZSslY&ab_channel=iBiologyTechniques
Elektronen in fluoroforen kunnen na excitatie -> verhoging van schil -> verlies van kinetische energie -> verlies van fluorescent licht en terugvallen naar grond toestand
Stimulated emission depletion:
moleculen terugdringen ahv een 2de lichtbron naar grondtoestand voor dat ze fluoresceren -> zorgt voor een fijnere resolutie door een gefocusde airy patroon te hebben (-> zeer kleine regio belicht )
- De 2de lichtbron heeft een leegte int midden (donut vorm), zodat het de airy disk achterlaat.
- Wanneer de intensiteit van de 2de laserlicht (donut) verhoogt, kan die een heel fijn airy disk uithalen, omdat de donut opening smaller wordt (= diffractie randen uitgehaald) (dringt dus meer moleculen terug, zodat ze geen fluorescentie uitstralen na excitatie)
Bespreek near field
-near field >dicht bij de bron >spreidt uit in enkele nm, en gaat verloren >kortere golflengte >heeft hogere resolutie
Examen vraag: Geef enkele klassieke technieken die de resolutie verbeteren en superresolutie technieken en geef het verschil aan tussen beide soorten technieken
bespreek zaken die omheen diffractie limiet werken:
-confocale microscopie
-deconvolutie
- far field
>sim (structured illumination microscopy)
>4pi belichting
-nearfield
>evanscenst waves
Technieken die diffractieliet overbruggen
-superresolution
>pointillisme
>stimulated emission depletion (STED)
