HC 9 - Proteomics II Flashcards
Hoorcollege 9
Waarom is de data van bottom-up proteomics incompleet?
-Proteases (vaak trypsine) en limitaties van de massa range van de massaspectrometer
-Niet alle peptiden zijn informatief voor identificatie en kwantificatie
-Sample complexiteit en duty cycle (meetcyclus) limitaties in Data Dependent Analysis
-Een grote dynamic range van het proteoom (niet alle eiwitten zijn in gelijke hoeveelheid en dus intensiteit aanwezig en je kunt ze missen)
workflow proteomics
-Extractie
-Digestie
-Purificatie
-LC-MS analyse (MS > MS^2)
-Proteeom database search
Hoe kan vouwing van een eiwit de resultaten verpesten?
Trypsine kan disulfide bruggen tussen de cysteïneresiduen knippen maar soms knipt deze niet goed en houd je deels gevouwen pepides over waar de digestiemix niet bijkan en dan blijven ze aan elkaar vastzitten
Wat doen TCP en CAA
TCP reduceert disulfidebruggen en hervorming wordt voorkomen door CAA toe te voegen die de cysteïnes modificeert met hydroxymethylatiegroep
Waarom is de MS meting onvolledig?
De MS informatie zegt alleen wat over de gemapte (in MASCOT rood) stukjes die met fragmentspectra bepaald zijn en zijn gematched aan een eiwit.
> je hebt geen info over delen van het eiwit die geen coverage hebben en variatie in dit gebied is niet gemeten
> je kunt geen PTMs van een non-mapped peptide meten omdat je geen fragmentspectrum hebt
Trypsine peptidase functies en nadeel
Knipt carboxyterminaal van en lysine (Lys, K) of Arginine (Arg, R) aminozuur.
> niet alle eiwitten hebben in alle stukkje lysines en arginines dicht bij elkaar zitten waardoor er fragmenten ontstaan die buiten de window of measurement liggen omdat de precursor te lang is.
Waarom bepaal je een window of measurement bij MS?
Omdat we niet geïnteresseerd zijn in hele korte en lange stukken (minder betrouwbaar??)
In welke eenheid meten we peptide massa of aminozuur massa? Hoeveel is dit per H molecuul (proton)?
amu / u
1.007 amu per H
Welke delen van de precursor zijn geladen bij tweevoudig geladen?
De laatste lysine en de aminogroep
Neutral peptide mass =
(m/z)z-(zH)
Unieke peptide / proteotypische peptide
Een deel van de lijst van peptiden die uniek voorkomt in 1 eiwit
Wat kun je zeggen na MS over je sample en protein groups?
Je hebt bewijs dat de protein group in de sample zit maar niet altijd welke eiwitten in de sample zitten
> protein interference
Wanneer is een peptide niet informatief?
Wanneer het niet aangeeft welke eiwitten er in het sample zitten.
Wat kun je zeggen over kwantificatie wanneer een peptide in meerdere eiwitten voorkomt?
Je kunt ze niet goed kwantificeren (shared)
> als deze twee eiwitten ook een peptide hebben die uniek is voor het eiwit dan kan het wel gekwantificeerd worden: proteotypisch.
Kwantificatie bij unieke peptiden
Ratio’s berekenen van unieke peptides tussen de samples om verschillen te kwantificeren in eiwit abundantie
> kan ook voor sommering van aantal eiwit voor de unieke peptiden en dan het ratio voor de eiwitwaarde voor intensiteit (zelfde eiwit tussen twee samples)
Wat geeft in de massaspectrum de kwantificatie aan?
Het oppervlakte onder de pieken
De limitatie van de massaspec duty cycle bij LC-MS
Na 10 seconden is een piek weg en de massaspectrometer moet dan detecteren, selecteren en fragmenteren.
> de chromatogram loopt door met loslaten van hydrofiel naar hydrofoob maar de detector heeft maar een korte tijd om de peptiden te selecteren en te fragmenteren om fragmentspectrum te maken.
> er is een limiet aan hoeveel fragmentaties er tegelijk gedaan kunnen worden: nieuwe peptiden die van de kolom afkomen kunnen daarboven niet gemeten worden.
Waarvan is de soorten peptiden die we per eiwit meten afhankelijk?
Van de peptidase > indien trypsine afh van de lysine-arginine koppeling.
Bij een 100 Hz fragment spectrum frequentie zorgt bij 60 minuten gradient in de LC voor 360,000 spectra en theoretisch bij 24h voor 8.6 mln spectra. Toch ligt het maximum lagerL op 1.6 mln theoretisch. Waarom?
Omdat
-de massaspectrometer selecteert en fragmenteert soms dezelfde peptide meerdere keren > herselectie
-groter aantal precursors door isotopen
-het is veels te langzaam tevens
Raken peptiden bij een 24h theoretisch gezien niet op? Wat is het nadeel?
Nee, maar het grote nadeel is dat je de oppervlakte onder de piek uitsmeert over langere tijd, daardoor is onderscheid misschien beter omdat de pieken niet allemaal over elkaar komen te liggen (dat is het doel), maar omdat je doorslaat worden de pieken zo laag dat de achtergrondsruis alle pieken verbergt. Daarom is er dat maximale peptide meting van 1.6 mln.
Hoe kan in kortere tijdsgradiënt toch meer worden gemeten?
Hogere frequentie (Hz) > meer tegelijk meten dus sneller meten
Limitatie dynamic range: voorbeeld met bloed
Het bloed bestaat 95% uit albumine als eiwit maar interessanter voor detectie zijn de interleukines die veel minder voorkomen omdat ze worden overschaduwd en daarom niet in de meting worden meegenomen.
> als er meerdere geladen deeltjes bij de detector aankomen dan wordt een klein aantal peptiden met lading 1 niet geselecteert omdat het niet hard genoeg ‘schreeuwt’.
Wat zou een ideale detector zijn gezien de dynamic range?
Eentje met een oneindige dynamic range die zowel abundante eiwitten als de dark corner tegelijk meet.
Hoe kan de dark corner (weinig voorkomende eiwitten) toch worden gemeten?
Sample scheiden: de range van metingen veranderen door exclusie van abundante eiwitten.
Is het dynamisch bereik hetzelfde voor alle metingen?
Nee, het verschilt per weefseltype: ander aantal eiwitten en ander dynamisch bereik.
Hoe kun je van hetzelfde sample meer meten?
In aparte parten het sample door de massaspectrometer runnen
> je kunt dan ook meer tijd hiervoor inboeken in het lab want je meet meer per run.
Oprekken dynamisch bereik
Parten maken van de sample op basis van eiwitniveau (grootte) en de donkere vakjes bij elkaar zetten in een part
HpH-RPLC
Methode van peptide level fractionatie (2D proteomics) (High pH Reverse LC > apolair)
-Scheiding sample
> Fracties van peptiden opvangen
> Verschillende stukken gradiënten samenplakken (poolen)
> de pools opnieuw injecteren
HpH-RPLC voor pH=10 als eerste conditie en dan pH=2 voor tweede conditie
Sample scheiden op hoge pH conditie pH=10
> peptiden samen pakken van de verschillende delen van het chromatogram en re-injecteren in pH=2 (verkrijgen andere retentietijd door andere conditie)
> nieuwe scheiding uit de LCMS analyse
> meer identificaties
Ion Mobility Seperation (Drift Tubes, TWIMS, TIMS)
Een extra scheiding bepalen voorafgaand aan de orbitrap, TOF of Q op basis van grootte.
-DTIMS: elektrisch veld naar rechts, gasstroom naar overal. Kleine eerst.
-TWIMS: gasstroom naar links en elektrisch veld naar overal. Kleine eerst.
-TIMS: Elektrisch veld naar links en gasstroom naar rechts
> scheiding op tijd
> hoe groter, hoe langzamer
> vaste tijdsinterval bepaald (MS range) > gescheiden, andere orde van grootte en daarom niet herkend als aparte retentietijd.
Data Indepedent Analysis (DIA)
ipv fragmentspectra bij geselecteerde precursors bij alle precursors de fragmentspectra meten: je weet niet meer bij welke precursor welk fragmentspectrum hoort
> met elutiepatronen opnieuw matchen
Applicaties van proteomics
-Veranderingen in eiwitabundantie
-Expressie proteomics tussen verschillende samples (bv resistentie in de oncologie)
-Eiwitniveauverandering in bepaalde setup meten
Eiwitniveauveranderingen meten
Kwantitatieve proteomics > een lijst met getallen per eiwit tussen samples/condities.
> relatieve veranderingen per eiwit
Waarom is kwantitatieve proteomics toch niet zo kwantitatief
Per peptide ligt het er ook aan hoe graag ze ion willen worden (ionisatie-efficiëntie)
Wanneer kan abosolute kwantificatie?
veel peptiden meten met een bepaalde samenstelling
Hoe kunnen veel verschillende cellijnen en celtypes worden vergeleken in eiwitexpressie?
Online databases
Hoe gaat interactie proteomics met eiwitcomplexen te werk?
Via co-immunoprecipatie
> voorzichtig zijn met wassen of vastzetten met formaldehyde
> eiwit met bekend complex wordt via antibody pulldown gepurificeerd
-> welke eiwitten worden er meegetrokken met de ‘bait’? kwaliteitscontrole en dan identificatie via MS.
Subcellulaire proteomics voor eiwitlokalisatie
Organellen intact houden > scheiding organellen en op verschillende lagen terug laten komen
-analyse met trypsine digeste en MS/MS detectie
-vergelijken eiwitten tussen verschillende organellen
-bottom-up shotgun proteomics zoals eerder maar dan deze scheiding voorafgaand
Waarom is het handig om op PTMs te meten?
Dan weet je bv of het eiwit aanstaat indien gereguleerd door fosforylatie.
Hoe weet je waar iets gefosforyleerd is?
In het fragmentspectrum kun je een verschilwaarde aantreffen die een aminozuur voorstelt met fosforylatie
> let op: dit kan alleen serine (S), threonine (T) of tyrosine (Y) zijn
Hoe wordt het duidelijk uit een verschilwaarde welke modificatie van toepassing is?
Verschillende PTMs hebben een ander bekend massaverschil: bv fosforylatie = 80
> eigenlijk verandert dan ook de lading omdat een fosfaatgroep 1- is, maar dit is vgm niet voor de toets
Noem verschillende modificaties en evt welke aminozuren ze van toepassing zijn
-Fosforylatie: massaverschil 80, op S, T, Y
-Acetylatie
-Glycosylatie
-Methylatie: carboxamidomethylatie kan alleen op cysteïne
-Ubiquitinatie
-Oxidatie: alleen methionine
Hoe heet de fosforylatie die op serine, threonine en tyrosine residuen kan?
O-fosforylatie
Waarvoor is fosforylatie belangrijk in de cel?
signaaltransductieroutes
Waarom is fosforylatie lastig te meten bij bacteriën?
Er komt bij bacteriën veel Histimine fosforylatie voor.
Problemen met analyse van fosforylatiepositie
-Fosforylatie is een dynamisch proces (signaal wordt snel uitgedoofd)
>fosfatases
-erg laag abundante componenten in het totale proteoom: onderrepresentatie zonder een enrichment
-ander gedrag van gefosforyleerde peptides: andere ionisatie
Enrichment van gefosforyleerde eiwitten
Lage abundantie oplossen: wegwassen andere peptiden en vasthouden van die gefosforyleerd zijn
Probleem met S en T in dezelfde peptide
Waar zat de fosfaatgroep? het valt misschien uit het fragmentspectrum af te lezen, maar de fosfaatgroep valt er snel af bij ionisatie door lage pH
Eiwitglycosylatie: op welke aminozuren?
Serine (S), Threonine (T), Tryptofaan (W), en methionine (M)
Wat maakt identificatie van glycosylatiegroepen lastig?
Het kan veel verschillende massa’s hebben afhankelijk van kleine modificaties van andere suikers
> heterogeniteit in modificaties verdunt de signaalintensiteit en je meet dan vooral niet-gemodificeerde peptiden
Types van eiwitglycosylatie en isolatie
-Suiker bindende eiwitten > lectines
-Epitopen > antistoffen
-Negatieve lading door glycaan >IMAC/MOAC
Ubiquitinatie: waarvoor dient het?
Markeren voor afbraak
Ubiquitinatie is homo/heterogeen en wordt gezet op …
Heterogeen: worden gezet op lysines
Probleem met detectie ubiquitinatie
Wordt op lysine (K) gezet, maar hier knipt trypsine en dan worden ook de ubiquitines eraf geknipt.
Overkomen probleem met detectie ubiquitinatie
Eiwitlevel enrichment met magnetische beads
> Ub-tagging based enrichment
> Antibody based enrichment
> UBD-based enrichment
Waarop kunnen de antibodies focussen voor enrichment bij ubiquitinatie?
-Op de dubbel glycine (daar bindt de ubiquitine): daardoor slaat trypsine lysines hiermee over.
-UbiSite antibody
PTM proteomics: verrijking is nodig en dit kan op peptide niveau door een fysiochemische eigenschap. Site specificiteit is essentieel voor de …
Elucidation(opheldering) of functional relations
> enrichments only prior to analyses
