Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

OMICS in de Biomedische Wetenschappen > HC 7 - Proteomics I > Flashcards

HC 7 - Proteomics I Flashcards

Hoorcollege 7

1
Q

Zijn de meeste gebruikte proteomics technieken top-down of bottom-up?

A

Bottom-up

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Welke eigenschap moet een eiwit hebben om de naam eiwit te krijgen?

A

De vouwing (tertiaire en evt quarternaire structuur)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Welke krachten zijn betrokken bij eiwitvouwing?

A

-H-brug
-Vanderwaals
-Hydrofobe kracht
-Zwavelbrug

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Wat is het resultaat van interactie van verschillende gevouwen polypeptideketens?

A

Het verkrijgen van bijzondere eigenschappen

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Enzymen (ook eiwitten) kunnen via interacties andere eiwitten bijzondere eigenschappen geven. Noem een voorbeeld.

A

Cofactoren, glycosylatie of andere modificaties

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

De lokalisatie van een eiwit kan via een extra laag van regulatie worden gecontroleerd. Welke?

A

De post-translationele modificaties (PTMs)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Noem voorbeelden van PTMs

A

-Acetylatie > histoneiwitten bv
-Methylatie > histoneiwitten bv
-Glycosylatie
-Fosforylatie
-Ubiquitinatie

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Een eiwit wordt gecodeerd door een …

A

gen

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Bij eukaryoten wordt een eiwit getransleerd vanaf … door de ….

A

mature mRNAs; de ribosomen

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Hoe kunnen eukaryote eiwitten verder worden geprocesseerd?

A

Door proteases, of door andere enzymen die PTMs aanbrengen

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Welke structuur moet een eiwit minimaal hebben voor haar functie?

A

de tertiaire structuur

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Welke structuur moet een eiwit vormen in een eiwitcomplex?

A

Quarternaire structuur

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Hoe noemen we het molecuul dat een eiwit nodig kan hebben voor het kunnen functioneren?

A

Een cofactor

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Wat is het proteoom?

A

Alle gevouwen polypeptideketens die zijn gecodeerd door het genoom

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Hoe ontstaat het proteoom?

A

vanuit het centrale dogma (translatie vanuit mature transcriptome door ribosomen)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Benoem de systems biology van het proteoom (interactie met de andere omics)

A

Regulatie van het metaboloom maar ook terugslaan op het transcriptoom.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Benoem de voordelen van proteomics tov transcriptomics (RNAseq en microarrays): correlatie argument

A

-de correlatie tussen een transcript en het eiwit is te klein (het is variabel per eiwit)
>vanwege de complexe regulatie (translatie en degradatie)
>eiwitten hebben gemiddeld een hogere halfwaardetijd dan transcripten, dus indien je iets over het eiwit wilt weten kun je die beter zelf bestuderen.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

Is de degradatie van eiwitten verbonden qua regulatie met de aanmaak?

A

nee

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
19
Q

Voordelen proteomics tov transcriptomics: identificatie argument

A

Alleen met proteomics kun je de modificaties van eiwitten bestuderen.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
20
Q

Alle voordelen proteomics

A

-Transcript levels en protein levels correleren onvolledig
-Detectie translationele regulatie: transcripten én eiwitten nodig
-Eiwitdegradatie is niet verbonden aan transcript levels
-PTMs zien niet verbonden aan transcripten
-Eiwitlokalisatie is niet verbonden aan transcripten
-Complexe eiwitformaties zijn niet verbonden aan transcripten
-Eiwitmaturatie is niet verbonden aan transcript levels

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
21
Q

verschillende proteomics technieken

A
  1. Analytische scheiding van eiwitten
  2. functionele analyse eiwit
  3. eiwitstructuur analyse
  4. lokalisatie analyse
  5. eiwit detectie en identificatie
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
22
Q
  1. Analystische scheiding van eiwitten
A

-Scheiding op grootte: SDS-PAGE/gel elektroforese
-Scheiding op lading en grootte: kolomchromatografie (bv negatief geladen Histimine residuen in een Ni-kolom

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
23
Q
  1. Functionele analyse
A

-Colorimetrische essay
-Massaspectrometrie (effect van drugs op eiwit structuur en modificaties bekijken)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
24
Q
  1. eiwitstructuur analyse
A

-Cryo-EM
-NMR
-X-ray diffraction
-Protein X-linking
-Computional structure prediction > schatting van hoe de structuur verandert in bepaalde conditie

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
25
Q
  1. Lokalisatie
A

-Fluorescentie microscopie
>Spatial proteomics met coupes
-Per compartiment een massaspec (identificatie per regio)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
26
Q

Nadeel van fluorescentie microscopie voor lokalisatie

A

Je kunt maximaal 1 eiwit tegelijk meten, en er zijn veel verschillende constructen en dus antilichamen nodig

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
27
Q

Als er aan de oppervlak van het preparaat eiwitten afgenomen worden voor de massaspectrometrie voor lokalisatie en identificatie: welke eiwitten heb je dan te pakken?

A

De gesecreteerde eiwitten

28
Q
  1. eiwit detectie en identificatie
A

Bottom-up massaspectrometrie

29
Q

Wat meet de massaspectrometer in grootheid?

A

De massa over lading (m/z)

30
Q

Wat moet de massaspectrometer doen met de moleculen voor een meting?

A

Lading geven aan de moleculen

31
Q

Onderdelen van de massaspectrometer

A

-Ionenbron
-Massa analysator
-Detector

32
Q

Welke ionenbron wordt vaak gebruikt bij massaspec?

A

De electrospray ionisatie (ESI)

33
Q

Hoe werkt de ESI?

A

De ESI wordt gebruikt bij vloeistofchromatografie
> moleculen komen langs de naald waarbij het druppeltjes vormt met veel lading aan de buitenkant. Dan vindt er een soort explosie plaats waarbij de lading in het molecuul gaat zitten. De druppels worden eerst aerosolen en vervolgens gas (in gasfase raken van de peptiden)
> Vaak is de lading >1, zeker bij peptiden
> vaak protonatie (additie H+), moleculen worden zwaarder

34
Q

Massa analysator: de Time of Flight (TOF)

A

Na het geven van voltage aan moleculen wordt er een kracht geforceerd (duwen van de moleculen) > de opgewekte snelheid hangt af van de massa en lading.
-meten bij de detector wanneer er pakketjes met ionen aankomen na de vlucht door de vluchtbuis.
-elektrisch veld wordt bepaald door de lading > grotere lading, hardere trekkracht, andere vluchttijd

35
Q

Hoe kan de resolutie bij een TOF analyse worden verhoogd?

A

Door het toevoegen van een reflectron
-deze buigt de ionen af in de buis waaroor ze een langere afstand moeten afleggen, daardoor wordt het contrast in aankomsttijd tussen twee verschillende snelheden vergroot

36
Q

Welke natuurkundige formule is van toepassing bij TOF

A

Ek= 1/2 * m * v^2

37
Q

Massa analysator: Orbitrap

A

-Op basis van een formule die wordt gegeven bij de toets
-Moleculen (ionen) worden ingevangen > de moleculen krijgen draaibeweging
> Excitatie geven Afh. van massa en lading
> De oscillatie meten van hoe moleculen heen en weer gaan
> m/z berekenen vanuit de frequentie van draaien om de trap

38
Q

Wat moet er met proteomics samples gebeuren na het in de orbitrap gaat?

A

Fouiller transformaties: complexe frequenties van alle moleculen uit elkaar halen en daaruit het massaspectrum halen (via computer)

39
Q

Heb je een detector nodig bij massaspec met orbitrap?

A

Nee, want je doet geen telling of signaalintensiteit meting

40
Q

Wat betekent hogere resolutie voor contrast tussen massaspec-pieken op het massaspectrogram?

A

Hogere resolutie > hoog accuraat > beter contrast > scherpere pieken

41
Q

Rangschik de massa analysatoren van laag naar hoge resolutie. Kies uit:
Time of Flight - Quadrupole - Orbitrap - ICR

A

Laag-
-Quadrupole
-Time of Flight
-Orbitrap
-ICR

42
Q

Noem veelgebruikte massaspectrometers (combinatie analysatoren)

A

-Quadrupole + TOF
-Quadrupole + Orbitrap

43
Q

Waarom wordt er vaak een Quadrupole in de massaspectrometer gestopt?

A

Het kan goed ionen selecteren

44
Q

Workflow van Top-down proteomics

A
  1. Protein mix
  2. ESI
  3. Intacte eiwitten meten -> proteoforms meten (kan niet in cellulaire context met duizenden tegelijk)
45
Q

Workflow top-down massaspec met regular ESI

A

-Denaturatie
-Afh van hoeveelheid zijketens een lading laten opnemen: regular ESI
-eiwitten in complex in gasfase
-massa bepalen

46
Q

Wat is native ESI bij top-down massaspec?

A

Lading geven aan de eiwitten in gevouwen toestand en in gastoestand brengen mbv acetaat en ammonium

47
Q

Workflow bottom-up massaspec (deze vooral onthouden)

A
  1. Protein mix
    > extractie uit cel pellet
  2. Digestion (en purificatie)
  3. LC-MS (incl. ESI)
  4. MASCOT proteome database search
48
Q

Waarop wordt gescheiden bij fractiescheiding a.d.h.v. %acetonitile?

A

Hoge %acetonitile is hydrofoob.
> eerst laten de hydrofiele peptiden los (bij chromatografie) en daarna de hydrofobe stoffen
> in een grafiek zie je dan de hydrofobe peptiden.
> dit is al na de digestie, dus dit gaat over alle peptiden/precursors/fragmenten is het sample uit vele eiwitten

49
Q

Hoe kan een aparte peptide worden geanalyseerd op een bepaald tijdspunt in massaspec?

A

Er wordt voor een aparte piek (precursor/peptide/fragment) een fragmentspectrum gemaakt door het aparte peptide te scheiden. Deze pieken kun je aan MASCOT meegeven of zelf analyseren
> verschilwaardes tussen pieken komen overeen met een aminozuur met evt een modificatie

50
Q

Hoe gaat Classical Data Dependent MS/MS te werk?

A

Binnen de precursor worden alle fragmenten binnen een bepaald m/z window meegenomen omdat verschillende pieken met een m/z van een precursor niets zegt over de sequentie van het peptide.
> Peptiden gaan door de collision cell > teveel aan energie > moleculen gaan breken en een fragmentspectrum van de fragmenten van het peptide worden gemeten.

51
Q

Wat voor proces is MS^2?

A

MS^2 is een serieel, biased en discontinu proces

52
Q

Hoe verloopt de eiwitidentidentificaties vanaf de peptides > bepaling mass window?

A

Afhankelijk van de protease die je gebruikt bepaal je een bepaald mass window of measurement waarbinnen je metingen wilt doen (afh. van de ladingstoestand)
-aminoterminus kan goed met H+ geladen worden en bij de carboxyterminus kan een lysine (K) worden geplaatst die geladen kan worden met een +.
> tweewaardig peptide&raquo_space; uitlezen isotopenpatroon voor bepalen lading

53
Q

Hoe kan de lading worden bepaald uit het isotopenpatroon?

A

Tussen elke isotoop wordt een massaverschil van 1 verwacht.
- Z = expected difference/observed difference.
-Expected = 1
-Bij een verschil van 0.33 tussen elke isotoop: 1/0.33=3 > z

54
Q

Hoe bereken je de neutrale peptide massa uit een m/z?

A

(Neutral peptide mass + z H+)/z = m/z
((m/z)*z) - z H+ = Neutral peptide mass

55
Q

Hoe leest MASCOT een fragmentspectrum?

A

Als getallen, mbv precursormassa en fragmentspectrum wordt naar een peptide spectrum bekeken en de peptide wordt bepaald door het maken van een beste match in de sequentie op basis van de spectra.
> korte stukjes sequentie gemaakt door protein interference
> sommige MS/MS matches horen bij meerdere eiwitten
> maken combinatie van peptidestukjes en dan vergelijken met een database

56
Q

Hoe interpreteer je de MASCOT output?

A

Als een coverage van verschillende peptiden die het programma heeft kunnen koppelen aan een eiwit als een best mogelijke match

57
Q

Uit eiwitten A, B, C, D zijn de peptiden I, II, III, IV, V en VI gemaakt.
I: alignment met A en B en C
II: alignment met A en B en C
III: alignment met A en B
IV: alignment met A en B
V: alignment met D
VI: alignment met D
maak eiwitgroepen (unique, shared of subset) van de peptiden. En bepaal welke peptiden gebruikt kunnen worden voor kwantificatie.

A

Group 1: aligns with A and B: I, II, III, IV (shared)
Group 2: aligns with C: I and II (subset of group 1)
Group 3: align with D: V, VI (unique)
> only group 3 for quantification

58
Q

Probleem met kwantificatie bij MS

A

MS is niet kwantitatief en meet de massa van de ionen, er worden vaak peptides gemeten en niet eiwitten

59
Q

3 manieren van kwantificatie bij proteomics

A

-Label-free
-Metabolic labeling
-iTRAQ & TMT

60
Q

Label-free quantification

A

Sample opwerken > meten > in data-analyse samenvoegen
- precursors hebben een retentietijd en hoeveelheid

61
Q

Voordelen en nadelen van Label-free kwantificatie

A

Voordelen
- geen pooling van samples, maar op data level met elk sample mogelijk
- meest sensitieve identificatie, geen multiplexing nodig
Nadeel
-minder accuraat door gescheiden sample en LC-MS analyse

62
Q

Metabolic labeling

A

-Zware variant: isotoop gebalede Arg (R) of Lys (K)
-Lichte variant: ongelabelde Arg en Lys
-Dialysed serum (pooling van samples)

63
Q

iTRAQ & TMT

A

-Chemische labeling waarbij een reactieve groep aan alle peptiden gaat zitten aan de N-terminus en de lysine bij C-terminus
> 8-16 samples maken met aparte massa-tags
-Sequentie wordt gemeten uit fragmentspectra
-Relatieve hoeveelheid van eiwit bepalen uit de hoogte van de pieken

64
Q

Hoe ga je om met protein interference bij kwantificatie

A

-Relatieve hoeveelheid van eiwit bepalen uit de hoogte van de pieken
> maar dit kan niet bij niet-unieke mapping naar een eiwit en alle peptiden die naar alle twee eiwitten mappen
> alleen uniek gemapte (proteotypische) peptiden kunnen een specifiek eiwit kwantificeren (relatief tov van tweede eiwit)

65
Q

Peptidasen zoals trypsine knippen c-terminaal. Hoe doe je uit fragmentspectra een sequentiebepaling en hoe weet je of je met een b-ion of y-ion te maken hebt.

A

Bij een b-ion valt de N-terminus weg een zal de C-terminus het zwaarste fragment zijn. Als je vanaf de zwaarste piek meet (wat je moet doen) dan lees je dus van C->N.
Bij y-ion net andersom (N->C).
>Trypsine knipt na een K of een R. Kom je deze met zekerheid tegen, dan heb je te maken met een y-ion.
>pak de hoogste m/z van de reeks (wellicht aparte even/oneven reeks) en bereken verschilwaarden steeds opnieuw en koppel deze aan een massa van een aminozuur met evt modificatie.

OMICS in de Biomedische Wetenschappen (12 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2025 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions