HC 4 - Microbiome Flashcards
Hoorcollege 4
Microbioom kenmerken
-Een diverse gemeenschap van microben
-Divers
-Betrokken bij meerdere aandoeningen
Uitdagingen bij de culture van microbioom
-Lastig te isoleren of te groeien in cultuur
-voeden van elkaars producten > concurrentie
-elkaars milieu bepalen > pH
Hoe wordt de interactie tussen gastheer en microbioom gecontroleerd?
Door:
-microbiële blootstelling
-voedsel diversiteit en complexiteit (meer vezels = meer voeding microbioom)
-Medicatie
Functies van het darmmicrobioom
-Metabolisme > fermentatie van overteerbare substraten en de synthese van vitaminen en fatty acids voor overleving van het darmepitheel
-Immunoregulatie
-Mucosale gezondheid en pathogeenexclusie
Ziekte associaties met microbioom
-Obesitas, metabolisch syndroom(T2D)
-Auto immuunziekten en inflammatory disease
-colorectal cancer
-neurologische syndromen als Parkinson
Hoe kunnen microbiota werken als vroege diagnostiek?
Biomarkers
Welke behandeling mbt microbiota zorgt voor minder kans op invasie door C. difficile?
FMT
Simpele workflow van microbiomics
Sampling
> Processing
> Metagenome
> metagenomics
> Sequencing
Varianten van microbiomics
-Shotgun metagenomics
-Marker gene amplicons: metabarcoding
Wat is er nodig voor alignment bij metagenomics?
Een database met sequenties van vele bacteriën.
Wat is de eerste stap voor shotgun metagenomics?
Shotgun the DNA of all the organisms in the sample
> daarna worden er vanaf deze fragmenten korte reads gemaakt (sequencing)
Assembly bij shotgun metagenomics
Overlaps van reads worden samengevoegd tot grotere fragmenten van één genoom en het aantal reads wordt per soort gen geteld.
Wat is de conclusie als er veel reads worden geteld bij gen X, Y en Z in dezelfde metabole route in een shotgun metabolomics sample?
Dat betekent dat deze route erg veel voorkomt in het totaal van de microbiota in het sample
Hoe kan worden bepaald of een subset microbiota vanaf de moeder bij de baby is gekomen of niet?
Op basis van SNPs
Hoe zijn kleine verschillen in het metabolisme van het microbioom zichtbaar te maken?
Metagenomics en sequencing
Doel metagenomics
Potentie van de verschillende gemeenschappen bepalen
Multiomics doel
Activiteit van de gemeenschappen en populaties binnen de gemeenschappen bepalen
Functies metaproteomics en meta-transcriptomics
-Welke eiwitten zitten in het microbioom
-Maken functionele profielen
-Bepalen activiteit
Functie Marker gene amplicon studies
Structuur en compositie van de verschillende gemeenschappen bepalen
Welke marker wordt gekozen om verschillende bacteriën uit elkaar te halen terwijl het in elk genoom voorkomt?
Het 16S rRNA: kleine subunit van ribosomale RNA onderdeel > minstens 1 kopie in elk genoom van de bacteriën
> sterk geconserveerd in evolutie, maar bevat variabele regio’s waar ze tussen soorten verschillen
Waarop richten de primers bij marker gene amplicon studies?
De geconserveerde sequenties van het 16S rRNA gen > dan wordt alleen het amplicon geamplificeerd en gesequenceerd in alle microbiota
Waarvoor worden de reads in marker amplicons gebruikt?
Om te vergelijken tegen andere reads (er zijn meerdere reads per soort)
> tegen referentiesequenties voor 16S amplicons
Noem de verschillen tussen metabarcoding en metagenomics voor de onderdelen
: informatie over genomen, hoeveel reads nodig, hoeveel labwerk nodig, hoeveel bias, welke organismen worden gemeten, de moeilijkheidsgraad van het computerwerk, welk deel wordt gesequenced.
Informatie over genomen
-Bar: geen; Gen: Wel
Hoeveel reads
-Bar: minder; Gen: meer
Labwerk
-Bar: meer; Gen: minder
Bias
-Bar: meer; Gen: minder
Organismen
-Bar: alle met marker; Gen: ook off-target organismen wat zorgt voor interference
Computerwerk
-Bar: makkelijk en snel; Gen: moeilijk, langzaam
Welk deel seq
-Bar: 1 marker regio (amplificatie en seq); Gen: alle genomen
Uitdaging van microbiomics in de processing
Bias in de amplificatie en extractie
Uitdaging microbiomics in de sampling
Homogenisatie van spatiale structuren
Uitdagingen in de metingen van microbiomics
Onderscheiden van errors en niuewe organismen en genen
> probleem komt bij humane samples niet voor: read depth op dezelfde nucleotide
> bij microbioom: meerdere genomen en van vele organismen heb je onvoldoende reads om het betrouwbaar te onderscheiden
Data uit de microbiomics
Een aantal blokken van reads: forward en reverse in aparte bestanden
> FASTQ layout
Phred score Q formule
Q = -10log P met P = error probability (=-10^-Q/10)
> Quality trimming bij 3’end van de reads door lage kwaliteit
Wat is de stap in metabarcoding na het verkrijgen van high quality reads?
Clustering
> Onderscheiden van verschillende amplicon sequence varianten ASVs (OTUs)
> zelfde sequentie betekent een zelfde ASV dus zelfde taxon
Wordt een amplicon met dezelfde sequentie behalve een punt met een low quality verschil bij de cluster gestopt?
Ja, aangenomen onzekerheid van de sequencer
Wordt een amplicon met een punt verschil met hoge kwaliteit en zekerheid bij dezelfde ASV gerekend?
Nee, dit is echt een andere bacterie
Hoe kun je twee ASVs vergelijken?
Het aantal reads per ASV vergelijken > factor verschil bepalen
Identificatie van bacteriën uit de ASVs
Door middel van vergelijking met een database
-BLAST, of een aligner zoals bwa
Taxonomische classificatie
Maken van een woord met 8 letters (deel vd sequentie)
> doorschuivende met overlappende woorden met de reads (komt het deel van de sequentie voor als read en hoe vaak?)
> tellen hoevaak de woorden voorkomen
> staafdiagram maken die lijkt op een barcode
> profielen van frequenties van de woorden maken
> woordprofielen van een eigen sequentie met het profiel van bacteriën uit de database
Identificatie na shotgun metagenomics
De meestwaarschijnlijke posities van eiwitcoderende markers in de gensequenties vinden en herdefiniëren van de plaatsing gebaseerd op overall genoom gelijkenis
Kwantificatie bij de microbiomics: wat is taxonomic profiling en functional profiling?
Taxonomic profiling: aantal reads per taxon tellen
Functional profiling: aantal reads per gen tellen: hoeveel reads bij genen met dezelfde soort functie meet je?
