HC 10 - Introduction to Metabolomics Flashcards
Hoorcollege 10
Wat is metabolomics?
Detectie en kwantificatie van alle metabolieten in biologische samples
Hoe onderscheiden we proteomics met metabolomics?
<1500 Da : metabolomics: identificatie en kwantificatie van de kleine moleculen
Lipidomics is een subdeel binnen metabolomics, welke onderscheiden zijn er?
Apolaire moleculen, amphipathic moleculen, polaire moleculen.
Hoeveel metabolieten zijn er bekend (ongeveer)?
114,000
Metabolieten hebben verschillende oorsprongen: welke?
endogeen (metabolisme) of exogene bron (medicijnen, voedselm microbioom, cosmetica, vervuiling, plastics)
Voordelen en nadelen van metabolomics met massaspectrometrie
Voordelen
- hoge analytische sensiviteit
- bredere survey van metabolieten
Nadelen
-Identificatie is lastig
-Isotopische standaarden nodig voor kwantificatie
Wat houdt massaspec in?
Bepaling van de massa van atomen en moleculen door het meten van gevormde ionen die worden versneld en gedeflecteerd door elektrische en magnetische velden
Wat is Nuclear Magnetic Resonance (NMR)?
Een magnetische spin van sommige nuclei > binnen magnetisch veld absorberen en emitteren deze nuclei radiofrequentiegolven
> de chemische omgeving van de nucleus (het molecuul) bepaalt de exacte frequentie van resonantie
Voordelen en Nadelen NMR
Voordelen
-Nondestructief
-Kan in vivo
-Relatief makkelijk voor identificatie
-Kwantificatie zonder standaarden
Nadelen
-Lage analytische sensiviteit
-Alleen abudante metabolieten
Type metabolomics qua specificiteit
-Targeted
-Non-targeted
Kenmerken targeted metabolomics
-Makkelijker toe te passen, maar biased
Kenmerken non-targeted metabolomics
Unbiased, maar technisch lastig en risico op te veel onbekendheden door lastige kwantificatie.
Waarom wordt metabolomics toegepast?
Metabolieten zijn:
-directe kenmerken van biochemische activiteit
-geëxporteerd van cellen en kunnen in lichaamsvloeistoffen gemeten worden
Applicaties metabolomics
-Klinisch: ziekten, biomarker ontdekking, voeding
-R&D: onderzoeken fenotypische effecten mbv knockout en cellijn e.d.
Kenmerken van genetisch metabole ziekten
-Metabolieten als diagnostische biomarkers voor errors
-Mendelian
De meest voorkomende detectie bij hielprik is PKU. Wat is dit?
Een fenylalanine stapelingsziekte wat leidt tekort aan tyrosine
> deficiency van hydroxylase
» hersenschade en progressieve verlammingen en cognitieve achteruitgang
> neonatale screening
Wanneer wordt er voor genetisch metabole ziekten gescreend?
Als ervoor behandeld kan worden
Wat is het metabotype?
Het individuele profiel van metabolieten
> afhankelijk van exogene factoren (omgeving) en endogene factoren (genotype). Dit is een betere reflectie van het klinische fenotype
Uitdagingen in metabolomics
-Verschil in abundantie en concentratie
-Hydrofobiteit
-Lading
-Moleculair gewicht
Oplossing voor problemen met metabolomics als lading en gewicht en abundantie
Scheidingen
Wat zijn Hyphenated technieken in MS en noem deze.
Het zijn extra voorscheidingen, want het gehele metaboloom in 1 keer meten gaat niet
-Gaschromatografie
-Vloeistofchromatografie
-Capillair elektroforese
Noem de onderdelen van een massaspectrometer en de typen
-Ionisatie
>ESI
>MALDI
-Massascheiding
>Quadrupole
>TOF
>Ion traps
-Detectie
Wat meet MS en wat zijn 3 belangrijke stappen
Het meet de m/z
1. Convertion to gas-phase ions and into vacuum
2. ions are seperated according to m/z by electromagnetic fields
3. ions are detected and signal is processed to mass spectrum
Soft ionization: ESI
Je wilt oplosmiddel kwijtraken
> met hitte of stikstofgas en lading met hoog voltage op een naald zetten en steeds kleinere druppels maken totdat alle vloeistof weg is en de moleculen in gasfase zitten
> alleen nog hitte en gas toevoegen aan de spray die ontstaat door geladen naald om ionisatie compleet te maken
> + of -
MALDI
Voor spatial metabolomics: een laser op een matrix met de targets en door de laser de excitatie en de lading meegeven en per pixel een analyse voor spatiale informatie
Massafilters: quadrupole, orbitrap en TOF
Quadrupole
-lage resolutie: selectie en fragmentatie
Orbitrap
-Accumulatie van ionen
-metabolieten identificatie met hoge resolutie
-moleculen volgen bepaald pad om de orbitrale unit die karakteristieken geeft.
-Frequentie van rotatie is gecorreleerd aan de massa
TOF
-retentietijd meten na excitatie om tegen detector te komen
-Hoge resolutie, en die stijgt met de lengte van de vluchtbuis
Welke filters heeft een massaspectrometer meestal
Eerst een quadrupole voor de voorselectie van massa’s met keuze van een window en daarna een hoge resolutie filter
Wat houdt resolutie in?
De mogelijkheid om twee delen te onderscheiden
Hoe worden ionen gefragmenteerd bij massaspec?
Door gas en druk
Eerste scheidingen van bestandsdelen
Sample 1 voor apolair/amphipathic en sample 2 voor polair
-Sample 1
> Normal phase LC voor amphipathic – scheiding + en - (pos en neg)
> Reverse phase LC voor apolaire metabolieten – + en - scheiding
-Sample 2
>cHILIC LC – daarna + en - scheiding
Zijn anionische polaire metabolieten belangrijk in het centrale metabolisme?
JA > glycolyse, TCA cycle, nuceotides etc
cHILIC LC
Met een erg polaire kolom: ZIC-cHILIC kolom die is positief geladen, specifiek voor polaire compounds.
> maken chromatogram met verschillen intensiteit
> apolaire mobiele fase
Hoe kan de dynamic range worden vastgesteld?
Via een Two Day Stability Test
Hoeveel metabolieten zijn te meten per run?
250
In-source fragmentatie (probleem)
Stukjes van moleculen worden kapotgemaakt, bijvoorbeeld ipv een ATP krijg je een ADP en een P te zien en de ADP piek ligt recht onder de ATP piek, want ongeveeer gelijke massa.
Probleem met isomeren en isoberen
Die hebben gelijke massa > bv allemaal isomeren van glucose-1P (de hexose-P isomeren) > alleen glucose-6P is te onderscheiden bij LC.
Oplossing bij isomeren/baren metabolieten:
Ion mobility scan: verschillend door de kolom brengen: extra dimensie
> tijd, massa en mobility as
> hydroxy groep net op een andere plek bij de hexose-P metabolieten
Met lipidomics via Reverse Phase LC en Normal Phase LC en ladingsscheiding zijn 2500 lipideklassen te onderscheiden. Hoe wordt een klein verschil in retentietijd van dezelfde moleculen per sample gecorrigeerd?
Via bioinformatic pipeline
> clusterherkenning
> verschillen tussen de controles en de patiënt of de proefgroep
Hoe weet je welke vetzuurstaarten aan de lipiden zitten bij lipidomics?
Doen 4D lipidomics
> MS/MS info na fragmentatie
> Ion mobility meten
Wat doet de PASEF modus op TOF?
Het verhoogt het aantal MS/MS scans
Verschil 3D en 4D lipidomics
3D meet op
-Retentietijd (TOF)
-Massa
-Ion mobiliteit (CCS)
4D ook nog op
-MS/MS informatie (uit fragmentspectra)
Wat wordt vaker gebruikt: NMR of MS?
Massaspectrometrie (MS)
Waarvoor worden targeted en untargeted metabolomcis gebruikt
Targeted: target een pathway of klasse metabolieten
Untargeted: hypotheses maken
welk type metabolomics heeft het meeste ruwe data om te bioinformatic processen
Untargeted
