HC 2 - NGS + Exome (+ HC 1 - Introductie)

Question 1

Wat houden omics in?

Answer 1

Het meten van nagenoeg alle moleculen in een cel/weefsel/sample

Question 2

Functie omics (wat is er zo voordelig aan al die moleculen meten?)

Answer 2

Kwantificatie en identificatie van vele metabolieten tegelijk
> bv identificatie variaties en modificaties

Question 3

Waarom worden meerdere omics levels gemeten? (genomics, transcriptomics, proteomics, metabolomics)

Answer 3

Om interactie tussen de verschillende levels te kunnen waarnemen

Question 4

Het maakt niet uit waar je de genomics meet. Waar maakt het wel uit?

Answer 4

-Bij verschillende soorten tumoren (vergelijking met somatisch DNA)
-Bloedcellen: door verandering in genoom
-Huidcellen: door blootstelling aan UV-straling en verschillen door mutaties

Question 5

Welke extra dimensies kunnen er nog aan omics metingen worden toegevoegd?

Answer 5

Metingen over tijd en ruimte

Question 6

Stratificatie

Answer 6

Detectie van subgroepen
> bv op basis van een diagnose en eventuele mutaties, genomics of moleculaire markers een beste treatment toekennen

Question 7

Genoom bestaat uit … baseparen

Answer 7

3 miljard

Question 8

Hoeveel SNPs zijn er ongeveer bekend

Answer 8

1 miljard (verschillende plekken waar meerdere allelen voorkomen)

Question 9

Aantal nucleotiden in het humane genoom

Answer 9

3 miljard

Question 10

Aantal genen in het humane genoom

Answer 10

20,000

Question 11

Innovaties van NGS

Answer 11

Het gehele genoom van populaties kunnen sequencen en onderscheiden.

Question 12

Applicaties van NGS

Answer 12

-Variant detectie (SNPs, indels)
-Structurele varianten
-Splice varianten
-RNA-seq -> genexpressie
-CHiP-seq -> eiwitinteracties met DNA (TFs)
-Bisulfiet sequencing -> bepalen methylatiepatronen
Metagenomics -> bv alle bacterien in darmflora sequencen en compositie bepalen

Question 13

Sanger sequencing

Answer 13

Eerst amplificatie met de PCR -> van DNA/RNA naar DNA library met ddNTPs
> chain termination
> gelelektroforese
> sequentiebepaling

Question 14

Hoe lang zijn de Sanger DNA fragmenten

Answer 14

700-900 bp lang
> gaat wel langzaam

Question 15

Automatische dideoxy sequencing

Answer 15

Sanger met fluorescente markers ipv aparte kammen per nucleotide

Question 16

Illumina sequencing workflow

Answer 16

1. Library prep
2. Clusteramplificatie
3. Sequencing
4. Alignment en data-analyse

Question 17

Illumina library prep

Answer 17

-Fragmenteren (je kunt alleen stukje van 100-300 bp sequencen) met een enzym
> toevoegen adapters aan de flanken > ligatie > sequencing library.

Question 18

Illumina cluster amplificatie

Answer 18

-de fragmenten hybridizeren met hun 5’-adapter aan de probes die op de flow cell zitten
> bridge amplification: molecuul gaat buigen en adapter aan 3’kant bindt aan complementaire adapter > initiatie polymerisatiereactie > herhaling > cluster amplificatie tot clusters van fragmenten

Question 19

Illumina sequencing step

Answer 19

een pool van fluorescente nucleotides wordt toegevoegd en bindt aan de complementaire strengen van de geamplificeerde DNA op een clusterlocatie en uitscheiding lichtsignaal bij polymerisatiereactie
> tijdelijke blokkering door terminator op de fluorescente nucleotide > foto maken met detector
-wassen > klieving signaal en terminator > herhaal
-Binnen 1 cluster zitten de paired end forward en reverse strengen.

Question 20

Single-end sequencing

Answer 20

Sequencen van alleen de forward strengen en de reverse strengen weglaten
> goedkoper en sneller

Question 21

Paired-end sequencing

Answer 21

Eerst vanaf de 5’-end sequencen (forward) en daarna voor dezerlfde cluster alle foward strengen weglaten en reverse gebruiken (3’-end)
> accurater

Question 22

Bij welke reads is de accuratie hoger: grote of kleine

Answer 22

Korte reads –> alignment op andere plekken > meer betrouwbaarheid omdat elke nucleotide meerdere keren is gesequenceerd

Question 23

Coverage (read depth)

Answer 23

Aantal keer dat dezelfde nucleotide door verschillende reads is behandeld, en je streeft naar gemiddelde coverage van 30

Question 24

Bij paired-ends ontstaan er onbekende tussensequenties. Wat zijn deze?

Answer 24

Het stuk tussen de forward en reverse read gezien deze ver van elkaar af kunnen liggen.

Question 25

Multiplexing

Answer 25

Maximaliseren van de sequencing capaciteit en reduceren van de workflow van sample preperation via barcodes

Question 26

Barcodes

Answer 26

Unieke 5-10 basesequenties die aan de 3’-end van de template worden teogevoegd
> uniek per sample: elk fragment is te herleiden naar de sample of persoon bij wie het genoom hoort

Question 27

Sets van tot hoeveel verschillende barcodes zijn ontworpen?

Answer 27

96 barcodes voor max 96 individuen

Question 28

Soorten sequencing errors

Answer 28

-Incorrectly called bases (tijdens sequencing)
> kan ook voorkomen bij DNA library prep of PCR amplificatie
-Geen nucleotide ingebouwd > combinaties van fluorescentie want niet synchroon lopende cluster, geen goed signaal

Question 29

Is een error individueel te onderscheiden van een SNP?

Answer 29

NEE

Question 30

Hoe is het probleem van sequencing errors te overkomen?

Answer 30

Vergroten van het aantal reads > vergrootte coverage die inadequate metingen herkenbaar kan maken

Question 31

Mendelian disease soorten

Answer 31

-Autosomaal of sex-linked
-dominant of recessief

Question 32

cyctic fibrosis

Answer 32

taaislijmziekte
> autosomaal recessief

Question 33

Hoe worden bijzondere en veelvoorkomende allelen van Mendeliane ziekten opgespoord?

Answer 33

Bijzonder: exome sequencing
Veelvoorkomend: GWA

Question 34

Verschil tussen een SNP en een mutatie

Answer 34

SNP: in >1% van de populatie: komt veel voor
Mutatie: in <1% van de populatie: de novo

Question 35

Waar ga je in het genoom op zoek naar varianten met een grote effect size?

Answer 35

In het exoom

Question 36

Stappenplan Exome Sequencing

Answer 36

1. DNA verzamelen van patiënten
2. Exon capture
3. Sequencing
4. Verkrijgen humane DNA sequentie van publieke database (referentie)
5. Vergelijken van de sequencing resultaten
6. Filteren van de candidate mutations
7. validatie in het lab > resultaat: de SNP/mutatie die de ziekte veroorzaakt
8. Report the clinic

Question 37

Hoe onderscheid je een SNP van een sequencing error?

Answer 37

De coverage/read depth

Question 38

Wat verwacht je qua verdeling van de SNP bij een heterozygoot bij een allel

Answer 38

50% van de wild type en 50% met de variant

Question 39

Filtering of exome data

Answer 39

-Comparison of patients > select candidates if the genes are mutates in almost all the patients
-Synonymous SNPs do not change the protein so these are removed
-Candidates: SNPs between patients but non-synonymous

Question 40

Wat zijn de factoren om rekening mee te houden bij identificatie van causale allelen?

Answer 40

-Manier van overerving
-de novo of overerfbaar
-Stamboom van populatiestructuur
-Extensie van de locus heterogeniteit

Question 41

Hoe kan er uit de stamboom een de novo worden onderscheiden van een overerfbare SNP?

Answer 41

Mutatie/ziekte niet in de ouders –> de novo (makkelijker te zien als dominant want dan uit het in het fenotype, geen dragers)