Chapter 2 - Next Generation Sequencing

Question 1

Sequencing applicaties

Answer 1

-Full genome
-Variant detectie: SNPs vergeleken met referentie (of indels)
-Structurele varianten
-Splice variant detectie
-RNA-seq
-ChIP-seq
-Exome sequencing
-DNA methylatie detectie
-Metagenomics

Question 2

Indels

Answer 2

inserties en deleties

Question 3

Wat zijn structurele varianten bij DNA/RNA?

Answer 3

deleties, duplicaties, copy-number varianten, inserties, translocaties
> sequence affect: 1 kb - 3 Mb

Question 4

Van groot naar klein in sequence affected: structurele variatie, SNPs, chromosoom abnormaliteit

Answer 4

Chromosome abnormality > structurele variatie > SNPs

Question 5

Hoe ontstaan splice varianten?

Answer 5

Alternative splicing

Question 6

RNA-seq

Answer 6

sequencing en tellen van mRNA

Question 7

Toepassing ChIP-seq

Answer 7

analyse van eiwit interacties met het DNA
> ChIP (chromatin immunoprecipation met massively parallel DNA sequencing > mapping global binding sites

Question 8

Toepassing Exome sequencing

Answer 8

Detectie van genvarianten in het coderende deel van het genoom

Question 9

Toepassing DNA methylatie detectie

Answer 9

Epigenetisce markers identificeren zoals CpG-methylaties voor repressie van de transcriptie

Question 10

Metagenomics toepassing

Answer 10

Meerdere genomen parallel analyseren van environmental samples
> unbiased view of all the genes in the sample

Question 11

DNA capture techniek mechanisme -> toepassing bij exome sequencing

Answer 11

Gebruik van complementare probes aan regions of interest, in dit geval exonen
> de referentie sequenties voor het opstellen van de probes worden uit CCDS gehaald

Question 12

DNA capture technieken: microarray & solution capture

Answer 12

-Microarray capture: probes zitten vast aan een vast oppervlak > hybridisatie van exon fragmenten (uit bv fragmentatie/shotgun) met de probes > non gehybridiseerde fragmenten worden weggewassen > sequencing

-Solution capture: probes zitten in vloeistof en hybrisatie vindt plaats in vloeistof. Steptavidin beads worden gebruikt om de complexen neer te laten slaan > ongebonden fragmenten worden weg gewassen > overblijfselen worden gesequenced.

Question 13

Principe van Next Generation Sequencing

Answer 13

Sequencing terwijl de synthese van DNA door DNA polymerase nog bezig is vanaf een single strand template

Question 14

Sequencing-by-synthesis/ Illumina sequencing

Answer 14

1. DNA fragmentatie
2. enzymatische ligatie met adapter sequenties
3. binding van adapters aan de flow cell waar complementaire adapters aan vastzitten
4. amplificatie van elk gebonden DNA fragment
5. er worden spots gemaakt uit clusters van identieke single stranded DNA vanaf de fragmenten
   > nieuw toegevoegde nucleotiden bevatten een fluorophore die tijdens polymerisatie licht uitscheidt
6. detector vangt het licht, karakteristiek voor de verschillende nucleotiden, op en detecteert de sequentie.

Question 15

Welke eigenschap moeten de fluorophores van de nucleotiden bevatten om Illumina sequencing te laten werken?

Answer 15

Ze moeten als terminator werken die tijdelijk elongatie blokkeert tot de volgende wasstap zodat polymerisatie een-voor-een gebeurt, anders mengsel van lichtsignalen in een cluster/stipje

Question 16

Wanneer wordt fluorescentie gemeten? (voorafgaand aan welke stap?)

Answer 16

voorafgaand aan de verwijdering van de terminator van alle DNA moleculen

Question 17

Base-calling

Answer 17

Het detecteren van basen door de detector: bv door het aflezen van kleurensignalen bij Illumina sequencing op de aparte spots die elk een cluster van één fragment representeren

Question 18

Single-end sequencing

Answer 18

Nadat er fragmentatie en adapters additie heeft plaatsgevonden zullen de fragmenten maar vanaf één kant worden gesequenceerd (forward reads only)

Question 19

Paired-end sequencing

Answer 19

Sequencing vanaf beide uiteinden
> forward en reverse reads die als read pairs worden behandeld
> dubbel aantal reads in library prep
> de reads kunnen overlappen en in dat geval worden gecombineerd tot een langere single-end read na merging
> fragment lengte 200-500 nt
> accurater voor alignment en detectie van indels

Question 20

Mate-pair

Answer 20

Verschilt van de PE-seq in library prep
> 2-5 kb fragment selectie en sequencing van beide uiteinden
> informatie over hoe nucleotides van ver uit elkaar bij elkaar horen
> structurele varianten detectie
> voor oplossen van repetitieve gevieden tijdens genoom assembly.

Question 21

Wat zijn barcodes?

Answer 21

Unieke sequenties van 5-10 basen (meestal 8) die deel uitmaken van de sequencing adapters (onderscheiden van de samples)

Question 22

Voordeel van barcodes

Answer 22

Je kunt vele samples tegelijk sequencen: maximalisatie van capaciteitsgebruik van de sequencer.
> 8 base barcode > 96 barcodes > 96 samples max
> 12 base barcode > 384

Question 23

Index

Answer 23

Synoniem voor een barcode

Question 24

PCR na de multiplexing (barcode additie)

Answer 24

Emulsion PCR en daaropvolgend enrichment en deposition.
> na barcode additie een library prep van de gepoolde samples (alles in een soep gooien)
> sequencing templates van verschillende samples zijn niet langer gescheiden hierbij

Question 25

Vanuit NGS onstaat een vast getal van reads uit een pool van DNA fragmenten. Wat voor informatie kan dit geven?

Answer 25

Over biologische condities door vergelijing van read number met biologische condities

Question 26

RNA-seq principe

Answer 26

Vergelijken van aantal kopieën van elke mRNA transcript via sequencing van cDNA in verschillende celtypes of samples. (PCR voorafgaand aan de sequencing)

Question 27

PCR bias

Answer 27

Overrepresentatie van sommige sequenties > heeft invloed op de uiteindelijke library en de kwantificatie van DNA/RNA abundance

Question 28

Unique Molecular Identifiers (UMIs)

Answer 28

Korte random nucleotide sequenties die gebruikt kunnen worden als een absolute telmethode (uniek voor elk molecuul (bv DNA, eiwit))

Question 29

UMI additie

Answer 29

Elk molecuul in de populatie is uniek gemaakt door additie van UMI voorafgaand aan de PCR sequencing > UMIs komen in de library > moleculaire geheugen voor aantal moleculen in de startsample > elke UMI tellen om PCR bias te voorkomen > identieke kopieën scheiden van aparte moleculen door PCR amplificatie >> PCR errors bepalen

Question 30

Bij welke techniek zijn UMIs handig om te gebruiken?

Answer 30

RNA-seq > verbeterde detectie van laagfrequente moleculen

Question 31

Hoeveel unieke UMIs zijn er?

Answer 31

UMIs zijn 22 nt lang > 4^22 mogelijke UMIs

Question 32

Workflow UMI additie

Answer 32

1. extensie van primers met UMIs en p5/p7 adapters om de barcoded libraries te faciliteren voor Illumina 2. PCR 2 cycli > p5/p7 tagged amplicons inclusief UMI (via adapter aan flow cell) 3. Final library amplification (2e PCR) 4. Illumina sequencing tot Illumina reads

Question 33

Miscalled bases

Answer 33

Incorrect gemeten nucleotiden door de detector

Question 34

Error in NGS

Answer 34

- During library prep > unintended ligation or other polymerization error - During sequencing > more common: chance of incorporating wrong or nu nucleotide > degradation of light signals due to out of synch

Question 35

What is the limiting factor for NGS read length?

Answer 35

The sequencing error rate > length below 2 x 300 nt

Question 36

Calibration of sequencers

Answer 36

Estimation of likelihood of sequencing error depending on light signal

Question 37

Sequencing error rate

Answer 37

0.8% > 8/1000 - error is indistinguishable from a SNP > overcome problem by increasing number of reads > 8 reads > 0.8^8 % error rate

Question 38

Name the differences between NGS and Sanger Sequencing

Answer 38

NGS -- Sanger *library construction* NGS reads from fragment libraries -- cloning and amplification *parallelism* Parallel procession of millions of reads -- 96 reads at a time for gel electrophoresis *read length* 50-300 nt -- up to 1000 nt *error rate* 85-99% -- 99.999% *costs* 0.0002$ per kb -- 0.50$ per kb

Question 39

Were is long-read sequencing used for?

Answer 39

Indentifying Structural Variants, repetitive elements, copy-number alterations

Question 40

Read length with long-read sequencing

Answer 40

Longer than 1 kb > useful for transcriptomic research > entire mRNA transcripts > eliminate randomness in positions or size of genomic elements

Question 41

Third Generation Sequencing

Answer 41

newer ways of sequencing like nanopores

Question 42

Types of long-read sequencing

Answer 42

-Single-molecule real time sequencing -Synthetic approaches

Question 43

Single-molecule real time sequencing

Answer 43

-Does not rely on clonal population of amplified DNA -Asynchronous signal detection by fluorescent signal during polymerization of single DNA molecules. -No sequencing cycles > every signal from every molecule is captured on its own > no limit to read length than availability of nucleotides -higher error rate than short reads (weaker signal from a single molecule and chance of sequencer error)

Question 44

How can the error rate be lowered in Single-molecule real time sequencing

Answer 44

Sequence the same piece of DNA multiple times: but this reduces throughput

Question 45

Synthetic Third Gen Sequencing: Nanopore sequencing

Answer 45

Membrane with many pores, and the DNA strand is puled through. -electrical potential over the membrane -measuring the flux of currents through the pores specific for the sequence. -recognize short DNA sequences -no limit to length of DNA molecule except for mechanical stability of DNA -Base-calling is harder and error rates are higher than light-based base-calling

Question 46

What is more expensive: third gen (long-read) sequencing or regular NGS?

Answer 46

Third gen

Question 47

Data pre-processing steps

Answer 47

-Data conversion -Quality score and trimming -Sequence alignment / mapping -Coverage / read depth

Question 48

How is the Phred Score calculated?

Answer 48

Q = -log(p) Q: Phred score p: probability of sequencing error

Question 49

What is the error rate and accuracy for Phred scores 10 and 40?

Answer 49

10 > 1 in 10 incorrect base calls > 90% accuracy 40 > 1 in 10,000 incorrect base calls > 99.99%

Question 50

What happens to the quality across the read?

Answer 50

The quality decreases the further downstream (towards 3'-end) in the read

Question 51

You can remove the ends of the reads to improve their quality. But this does affect the quality of the sequence alignment. How?

Answer 51

The coverage will decrease (read depth at certain nucleotides)

Question 52

How is sequence alignment performed?

Answer 52

So that the most amount of matches is made in nucleotide/amino acid sequence

Question 53

Types of alignments

Answer 53

-Unique -Non-unique -Low confidence: unique but low quality score, lots of mismatches -No alignment

Question 54

Which read alignments are kept?

Answer 54

Unique alignments

Question 55

Which regions n the genome resemble the non-unique alignments?

Answer 55

Low complexity region, pseudogene, repetitive region

Question 56

Read depth (coverage)

Answer 56

the (average) number of reads representing a given nucleotide in the reconstructed/reference sequence

Question 57

What does a high coverage mean?

Answer 57

Increased reliability of the results like indentificaion of SNPs

Question 58

Breadth of coverage

Answer 58

Percentage of the DNA/RNA covered by all the reads

Question 59

Average coverage formula

Answer 59

N*L/G N: number of reads L: average read length G: length of the original genome

Question 60

Why is single cell sequencing only possible in the last X years?

Answer 60

because less DNA is needed for analysis

Question 61

Applications single cell sequencing

Answer 61

-Single cell processes: cancer: transformation, clonal evolution, metastasis, chemoresistance (transcriptomics analysis) -Study of micro-organisms which cannot be cultured direct (microbiome)