Gli Enzimi Flashcards
Come mai abbiamo tessuti diversi nel nostro corpo, nonostante lo stesso corredo cromosomico, quali tipi di enzimi troviamo?
-abbiamo enzimi diversi a causa del fatto che da un gene possiamo ricavare proteine diverse, quindi diversi enzimi e quindi diversi tessuti.
- nel nostro corpo oltre ai normali enzimi, troviamo i ribozimi, dove la parte catalitica è caratterizzata da un RNA e gli Ab- enzimi, ovvero enzimi in cui la parte catalitica è svolta da un anticorpo.
Quali sono gli utilizzi degli enzimi in campo medico?
Sono usati per comprendere, da dove provengono disordini metabolici, in farmacia sono usati come detossificatori, sono molecole bersaglio in chemioterapia, da un tipo ed una certa quantità di isoenzima è possibile capire l’origine di una patologia e nel caso seguirne la terapia.
Quali sono le caratteristiche generali degli enzimi?
perchè è importante il ruolo della catalasi?
come mai non possiamo digerire il la cellulosa?
cosa succede nella Lattasi?
-Sono proteine Globulari idrosolubili
-accelerano reazioni in ambienti con T,p,ph blandi
-partecipano ma non si consumano in una reazione
-non cambiano la costante di equilibrio ( che dipende dalla concentrazione di prodotti e reagenti)
-fanno raggiungere l’equilibrio più velocemente
-funzionano bene quando mantengono la loro forma
-hanno una alta efficienza ( fanno avvenire reazioni molto più velocemente)
-riconoscono 1 substrato e danno 1 specifico prodotto
-possono essere regolati in vari modi
Se considero ad esempio la reazione che decompone il perossido di idrogeno in molecole di acqua e ossigeno molecolare, La sua presenza potrebbe formare lo ione superossido ( che distrugge i tessuti).
se alla reazione aggiungo uno ione ferrico, La reazione è accelerata di 3 ordini di grandezza. Se invece inserisco il ferro nel gruppo eme di un enzima chiamato catalasi, la reazione sarà accelerata di 10 elevato a 8 ordini di grandezza.
L’enzima maltasi, riconosce il legame alfa 1-4 del maltosio ma non il beta 1-4 del cellobiosio.
solamente organismi che hanno le cellulasi, possono rompere tali legami, come i microorganismi presenti nell’intestino dei ruminanti
Un esempio di stereospecificità è la lattato deidrogenasi, che riconosce solo L-lattao e non lo stereoisomero d.
A cosa servono i cofattori enzimatici ?
Come mai non si potrebbe parlare di fad come coenzima?
Molti enzimi necessitano di piccoli metaboliti per funzionare.
c’è una divisione fra proteine semplici ( solo amminoacidi) e proteine coniugate ( aa+ cofattore)
un esempio di proteina coniugata è sempre la catalasi, la quale ha 4 gruppi eme. quando è senza cofattore ( lo ione ferrico) si parla di apoenzima, quando è presente si parla di oloenzima.
a differenza degli enzimi i cofattori non sono termolabili.
si parla di cofattore quando questa molecola è in grado di legarsi all’enzima, ma anche distaccarsi quando ha svolto la sua funzione.
Il fad invece si lega saldament evicino al sito attivo dell’enzima, dunque sarebbe più corretto parlare di gruppo prostetico più che di cofattore.
se ad esempio considero la diidrofolato reduttasi, in essa agisce il nadph, prende elettroni sottoforma di ione idruro e rilascia 1 H+ nell’ambiente.
se invece considero la succinato deidrogenasi, in seguito alla formazione del fumarato, il fad ridotto, rimane all’interno della reazione e una molecola come l’ubichinone può ridursi in seguito ad una successiva ossidazione del fad che agisce da scambiatore di elettroni.
Mi fai alcuni esempi di cofattori enzimatici?
Anche le vitamine possono agire da cofattori?
Ad esempio, l’alcol deidrogenasi usa lo zinco 2+
i citocromi lo ione ferrico/ ferroso
la glutatione perossidasi,usa la selenocisteina,alcuni metalli come il cadmio e il mercurio, potrebbero invece sostiturisi al posto dello zinco
- Anche le vitamine possono agire da cofattori. Infatti:
-La tiamina, chiamata anche vitamina B1 la ritroviamo nella tiamina pirofosfato, che ncatalizza il trasferimento di gruppi carbonilici.
- la riboflavina o vitamina B2 li ritroviamo nei coenzimi Fad e FMN e catalizza reazioni redox
-la <niacina, o vitamina B3 la ritroviamo nel nad , trasferisce ioni idruro
-L’acido pantotenico, ( B5) lo ritroviamo neo Coenzima A e trasferisce gruppi acile
-La piridossina ( B6) la ritroviamo nel piridossal fosfato e catalizza reazioni di transaminasi
- La vitamina B12 ( cobalamina) trasferisce gruppi metinici.
-Acido Folico trasferisce gruppi carboniosi
-Biotina aggiunge gruppi carboniosi
La nomenclatura degli enzimi.
Quante e quali classi di enzimi ci sono?
Ci sono 6 classi + 1 nuova classe di recente scoperta.
Gli enzimi si dividono in:
EC1 — ossidoreduttasi
EC2—-transferasi ( trasferimento gruppo funzionale)
EC3 —-idrolasi ( reazioni di idrolisi)
EC4—-liasi (rottura legami covalenti)
EC5— isomerasi ( reazioni di isomerizzazione)
EC6—Ligasi ( formazione legame covalente fra 2 molecole)
Un esempio di EC1 è l’alcol deidrogenasi vista nel Nad e nel fad, EC2 l’esochinasi della via glicolitica che aggiunge un gruppo fosfato, EC3 la carbossipeptidasi, EC4 la piruvato decarbossilasi, EC5 la Isomerasi che ad esempio converte l’acido maleico, che non ha nessuna rilevanza biologica in acido fumarico ( trans), per EC6 ad esempiola piruvato Carbossilasi.
La nuova classe sono le EC7 —-traslocasi
enzimi capaci di far passare metaboliti attraverso la membrana, come ad esempio ii canali trasportatori glut1 e glut2
Ogni enzima ha 4 numeri identificativi che descrivono la classe, la sottoclasse, il coenzima che utilizzano.
ad esempio il nome completo dell’alcol deidrogenasi è l’alcol Nad+ ossidoreduttasi.
Cosa si intende per ISOENZIMI O ISOZIMI?
a cosa serve l’elettroforesi dell’enzima LDH?
Sono enzimi che catalizzano tutti la stessa reazione, ma che sono codificati da geni diversi.
essi possono avere diversi cofattori, diversa cinetica, struttura e soprattutto LOCALIZZAZIONE nel nostro corpo. Ad esempio la lattato deidrogenasi detta LDH.
LDH catalizza la reazione che porta dal piruvato, alla formazione del lattato. Nella reazione, gli elettroni vengono trattenuti da LDH
Nel nostro corpo abbiamo 5 isoforme , ogni struttura è fatta da 4 subunità, ognuna delle quali può essere heart o muscle. Ogni isoforma ha Vmax e Kd diverse.
le 5 isoforme possono essere separate tramite elettroforesi, e distinte quindi in base al peso molecolare.
Quindi avrò maggiori concentrazioni di LDH1 a livello cardiaco e maggiori di LDH5 a livello epatico
Quando un tessuto si danneggia, le cllule liberano il loro contenuto a livello del siero, quindi se nell’elettroforesi noto dei valori con concentrazioni alterati di questi enzimi, posso non solo capire l’origine del danno, ma anche monitorare il processo di terapia. Se ho una maggiore presenza di LDH5 vuol dire che ho un danno epatico, se maggiore di LDH1 allora avrò un probabile danno cardiaco.
Come funzionano gli enzimi?
Cosa cambia da una reazione non catalizzata ad una catalizzata da enzimi?
QUESTO ARGOMENTO VA RIVISTO SUGLI APPUNTI
Se considero il normale fluire di una reazione chimica, avrò un substrato ad una certa energia, uno stato di transizione a più alta energia, ( la differenza fra questi due livelli energetici rappresenta l’energia di attivazione) e dei prodotti a più bassa energia. La differenza di energia fra il substrato e il prodotto è legata dalla equazione della energia libera di reazione ed è pari alla differenza tra energia del substrato ed energia dei prodotti.
Se considero l’equazione della velocità, V=k[A] elevato ad n dove n è l’ordine di reazione ( determinato sperimentalmente).
La costante cinetica la posso indicare con una relazione che la lega con un esponenziale decrescente alla energia di attivazione.
Più bassa è l’energia di attivazione maggiore sarà K.
L’energia di attivazione è l’energia supplementare che le molecole devono possedere, per raggiungere lo stato di transizione
SE INVECE CONSIDERO LA REAZIONE CATALIZZATA
- Ci sarà una energia di attivazione molto più bassa ( normalmente hanno una alta energia dello stato di transizione per evitare che la reazione possa tornare indietro).
- Questo fa aumentare K e quindi la velocità della reazione.
-l’enzima può percorrere meccanismi di reazione diversi anche a più tappe
-percorrendo una via alternativa, generano uno stato di transizione ad energia più bassa
-Essi interagiscono con legami TRANSITORI a livello del sito attivo, orientando l’incontro fra enzima e substrato. Questi legami si concretizzano nello stato ti transizione.
-Questo fa aumentare il numero di molecole che possiede una energia tale da arrivare allo stato di transizione, come indicato dalla distribuzione di maxwell-Boltzmann.
A cosa è dovuta a specificità e quali sono le caratteristiche del sito attivo?
Il sito attivo, fa orientare i reagenti, e tramite determinati residui aa, lega il substrato e lo fa reagire
-il sito attivo è una porzione molto ridotta rispetto all’intero enzima
-Gli aminoacidi del sito attivo possono anche trovarsi molto distanti sulla catena polipeptidica, ma vicini grazie al ripiegamento proteico.
-Nel complesso enzima substrato, il substrato subisce cambi conformazionali, che gli permettono di reagire.
- Il substrato ha minore libertà di movimento del sito attivo, che lo fa reagire più velocemente.
-per reagire, sia sito attivo che substrato devono essere desolvatati.
Come fa l’enzima ad abbassare l’energia di attivazione?
percorre meccanismi di reazione diversi, e inoltre, considerando il complesso enzima substrato, l’enzima stabilisce 2 tipi di interazioni:
Non covalenti—-> ponti salini, legami ad H, interazioni idrofobiche
COVALENTI TRANSITORI—> la loro formazione è accompagnata dal rilascio di energia libera chiamata energia di legame. Proprio questa energia è usata per abbassare l’energia di attivazione. Questo tipo di legami infatti hanno un contributo negativo sul delta H.
Se vuoi spiega l’esempio della metallasi sugli appunti.
Questa energia liberata dalla formazione dei legami transitori è la forza trainante della reazione catalizzata. Questa energia liberata è specifica per ogni complesso ES. Questo fa si che la catalisi sia un processo termodinamicamente favorito.
ad esempio il lisozima, che distrugge la parete cellulare fatta di peptidoglicani dei batteri, stabilisce delle interazioni deboli con il substrato.
Come mai lo stato di transizione è così alto nelle reazioni metaboliche?
Ci sono vari fattori, tra cui:
1) la riduzione entropica degli enzimi, infatti se enzima e substrato non sono legati, essi potrebbero disperdersi nell’ambiente cellulare, mentre nel momento in cui si legano, si ha una entropia minore. Poichè questo è un processo sfavorito, questo fattore alza l’energia di attivazione.
2)Quando poi enzima e substrato sono liberi, essi vengono circondati da molecole di acqua. Per instaurare quelle interazioni deboli di cui abbiamo prlato alllora è necessario rompere quei legami e quindi questo alza l’energia di attivazione.
3)Anche il fatto che l’enzima debba distorcere i legami presenti all’interno del substrato, concorre a far aumentare l’energia di attivazione. Tuttavia questa distorsione è in pare compensata dagli amminoacidi presenti nel sito attivo.
i fattori 1) e 2) sono compensati dalla formazione delle interazioni deboli.
Inoltre la RIDUZIONE ENTROPICA DEGLI ENZIMI, fa sì aumentare l’energia di attivazione, ma allo stesso tempo accelera la reazione , perchè limita i movimenti del substrato. Questo incide sul famoso fattore A dell’equazione di arrhenius, che rappresenta il NUMERO DI URTI REATTIVI. Questo fa aumentare la costante cinetica e quindi la velocità della catalisi.
Mi fai un esempio di adattamento indotto negli enzimi?
L’esochinasi, una molecola che fosforila il glucosio, nel momento in cui lega il substrato, porta i suoi amminoacidi reattivi, nelle posizioni corrette.
-la reazione dell’esochinasi, accompagnata dall’idrolisi di 1 atp, froma il glucosio-6-fosfato. Nel momento in cui l’enzima è legato, subisce anche esso un cambio conformazionale.
-possiamo pensare che nel momento in cui si lega il glucosio, le molecole di acqua sul sito attivo vengano allontanate.
-Ci sono situazioni particolari dell’adattamento indotto, come nel caso in cui al posto del glucosio, l’enzima leghi lo xilosio, il quale ha un carbonio in meno rispetto al glucosio e che quindi non viene fosforilato, al suo posto viene fosforilata una molecola di acqua che non fa altro che simulare il gruppo -OH mancante dello xilosio e questo comporta comunque l’idrolisi di 1 atp.
La cinetica Enzimatica, quali sono i valori che la influenzano?
Cosa succede al grafico di reazione se modifico SOLO la concentrazione di substrato?
che relazione c’è tra la velocità iniziale e la [S]?
- I fattori che influenzano una reazione enzimatica sono: la concentrazione di substrato, quella dell’enzima, la temperatura e il Ph.
-Se considero la variazione di [S], partendo dal presupposto che, (Vedi sugli appunti)
Mantenendo costante la [E] e variando[S] posso studiare la v0 ovvero la velocità con cui comincia la reazione.
infatti se disegno la tangente della curva che rappresenta la [S], ottengo le velocità relative a diverse [S]!
Confrontando diverse [S], capisco che dove ho [S] maggiore ho anche una velocità di reazione maggiore.
Il modello di reazione enzimatica cambia se c’è più di 1 substrato?
Quale è il grafico risultante, se considero una variazione solo del [S], con [E] costante, con la velocità sull’asse delle ordinate e [S] sulle ascisse?
la risposta è NO, anche se la maggior parte delle reazioni enzimatiche usa più di un substrato, i parametri rimangono sempre KM e Vmax.
-Il grafico risultante assomiglierà ad una iperbole, dove è possibile distinguere 3 zone a diverse cinetiche di reazione.
1 zona con bassa [S], dove c’è una proporzionalità diretta fra v0 e [S], quindi una cinetica di 1° ordine
questo perchè molti enzimi in questa fase sono ancora liberi
2 zona dove c’è una cinetica mista, a causa del fatto che molti enzimi cominciano ad occuparsi
3 zona dove la cinetica diventa di ordine zero, infatti a [S] elevate non ci sarà un ulteriore aumento di v0, infatti quasi tutti gli enzimi saranno occupati, la v0 dipenderà solo dalla costante cinetica.
A cosa serve l’equazione di Michaelis-Menten?
-Come arrivo a questa equazione?
-Serve a spiegare la cinetica DELLO STATO STAZIONARIO
(questa parte va rivista dagli appunti)
- Si parte considerando la reazione di formazione di E+Prodotto, e le relative costanti di associazione e dissociazioni del complesso ES,EP.
-Man mano che la concentrazione di [S] diminuisce, aumenta quella di [ES], molto velocemente fino a raggiungere il cosidetto stato stazionario, in cui non può formarsi ulteriore [ES] perchè non è più presente enzima libero.
-Dunque la tappa limitante la velocità di reazione è proprio la formazione di EP a partire da ES quindi la costante da prendere in considerazione è la k2.
Quindi v0=k2[ES]
-Considerando i primi momenti della reazione, la [P] è trascurabile, di conseguenza anche la k-2, perchè a basse concentrazioni di S, è improbabile che EP vada a riformare ES.
- Un altro aspetto da considerare è che poi a livello fisiologico la [S] è sempre più alta della [E], Quindi ES assume velocemente un valore costante ( stato stazionario).
-Ora considero la velocità di Formazione di ES
-V1=k1[E][S]
-se considero invece la velocità di dissociazione di questo complesso, ottengo che è data da due reazioni:
v2=k-1[ES]+k2[ES]
k2[ES] è la possibilità che l’enzima si dissoci a dare E+P
- se considero allora queste 2 velocità uguali, ottengo l’equazione:
v0=Vmax[S] / Km+[S]
dove Km è la costante di Michaelis cioè k-1+k2 / k1
Vmax non è altro che K2 per [E] poichè E è la quantità limitante.
Qual’è il grafico risultante dall’equazione di Michaelis Menten, quali sono le sue caratteristiche ?
a cosa servono i parametri Vmax e Km?
-Il grafico risultate da un grafico, ponendo V0 sull’asse delle ascisse e la [S] sulle ascisse è un ramo di iperbole
-essa presenta un punto sulle ascisse chiamato Km che rappresenta k-1+k2 / k1, e siccome k2 è molto più piccola dato che è la costante cinetica della tappa limitante, si può trascurare quindi al posto di Km si parla di KD ovvero costante di dissociazione del complesso ES, ovvero la [S] a cui compete la metà della velocità massima.
- Tuttavia da questo grafico non è possibile evincere il vero valore di Vmax a causa di un asintoto.
- Se consideriamo l’approssimazione fatta per KM=KD, è anche possibile dire che Kd indica l’affinità dell’enzima per il substrato. Poichè Km è pari alla costante di dissociazione, vuol dire che maggiore è Km minore sarà l’affinità dell’enzima per il substrato e viceversa.
-KM e Vmax sono parametri specifici per ogni enzima per un certo substrato: Ad esempio L’esochinasi ha una km per il glucosio di 0,05 ( molto affine ) mentre di 1,5 per il fruttosio, quindi molto affine.
Come cambia il grafico e l’equazione di Michaelis-Menten a [S] basse?
A [S] basse, la v0 diventa [S]Vmax/Km, il hgrafico diventa molto più ripido
A [S] Alte, v0 diventa uguale a Vmax, l’iperbole risulta più schiacciata.
Come mai a livello fisiologico, abbiamo [S], vicine ai valori di Km?
abbiamo visto che a [S] alte, si assume uno stato stazionario, cioè variazioni di S, non influenzano la velocità
A [S] basse o comunque vicine a Km, invece c’è una diretta proporzionalità fra [S] e velocità, quindi piccole variazioni si [S] influenzano il fluire della reazione.
Di conseguenza, a livello fisiologico, ritroviamo quelle [S] vicine a Km per controllare le reazioni.
Cosa è la costante catalitica? come la ottengo
Cosa è l’efficienza catalitica?, come la ottengo
-Considero le 3 costanti di associazione/ dissociazione della reazione che porta da E+S a E+P.
-la tappa limitante è sicuramente la terza, cioè quella che non permette ad altro substrat di legarsi. Quindi per la veocità considero Vmax= k3 [E].
-la Kcatalitica si definisce come il rapporto fra Vmax e [E]
-Equivalendo [E] ottengo che Kcatalitica = K3
La costante catalitica è anche chiamata numero di Turnover, e rappresenta il Numero di molecole di substrato che vengono catalizzate da un enzima in una unità di tempo.
-Allora se considero l’equazione di Michaelis-menten, sostituendo a Vmax il valore Kcat[E], cosniderando [S] basse, ottengo che
V0=Kcat/Km = [E][S]
L’efficienza catalitica non è altro che il rapporto fra Kcatalitica e kMichaelis
-osservando questa relazione inoltre notiamo che c’è una cinetica di 2° ordine.
L’efficienza catalitica, dato che è un rapporto, ha un limite superiore?
Come faccio a conoscere il valore esatto di Vmax ?
Quali sono i punti caratteristici della retta di Lineweaver-Burk?
la risposta è Si, ed è dettato dalla velocità di diffusione libera dei reagenti nell’ambiente cellulare.
-Se Vmax ha un valore confrontabile con quello dell’efficienza catalitica, questo indica che esso ha una buona efficienza
-Ad esempio la catalasi ha Kcat o n° di turnover pari a 40 000 000 (s^-1). i valori di Kcat/ km sono pari a 10^8 quindi l’enzima ha una buona efficienza.
-Per ottenere il valore esatto di Vmax é sufficiente una elaborazione matematica chiamata dei doppi reciproci, che a partire da una iperbole ci fa ottenere un grafico in cui 1/v0 = Km/Vmax[S] + 1/Vmax.
Il grafico ottenuto è una retta, e si chiama grafico di Lineweaver-Burk.
Questa retta ha come ordinata all’origine 1/Vmax e come coefficiente angolare Km/Vmax, e interseca l’asse delle ascisse in un punto che è pari a -1/km
Questo permette ovviamente di risalire al valore esatto di Vmax.
Se considero un enzima con più di un substrato, quali sono i vari tipi di meccanismi con e senza formazione di un composto ternario?
Cosa è il composto ternario?
Quale è un esempio di reazione a Ping Pong?
ci possono essere 2 meccanismi in cui si forma il composto ternario, ovvero un momento in cui
l’enzima è legato sia al 1° che al 2° substrato:
1) ORDINATA, nel quale c’è un preciso ordine di ingresso e di uscita del 1° e del secondo substrato
2) CASUALE, non c’è un preciso ordine di ingresso/uscita del 1° o del 2° substrato.
1 meccanismo invece non prevede la formazione del composto ternario, ed è chiamata reazione a PING PONG
in questo tipo di cinetica, non si forma un composto ternario, ma gli enzimi si legano reagiscono e si slegano dall’enzima continuamente.
Ad esempio, nelle transaminazioni, l’interazione di E con il primo substrato, modifica l’enzima che poi potrà reagire successivamente, con l’altro substrato.
Come faccio a capire, a livello sperimentale, se l’enzima forma il composto ternario o effettua una reazione con meccanismo Ping Pong?
Si può dedurre se si traccia il grafico di Lineweaver-Burk, rispetto all’ensima in esame.
se mantengo la [S1] costante e vario quella di S2, se le rette si incontrano, significa che si forma un complesso ternario.
se invece le rette risultano tutte parallele, allora la reazione segue un meccanismo a Ping Pong.
fin ora abbiamo solo considerato la situazione in cui varia [S], ma cosa succede se invece varia la [E]?
Semplicemente, se considero una quantità doppia dell’enzima, la Velocità massima raddoppierà e Km ovviamente rimarrà costante perchè raddoppiando Vmax, Raddoppia anche Vmax/2.
Cosa succede se invece vario la Temperatura?
se sull’asse delle ordinate pongo l’attività enzimatica e sulle ascisse la temperatura, noterò che gli enzimi hanno un picco di attività tra 40 e 60 °C
Tuttavia a valori molto alti, comincia il processo di denaturazione, che fanno perdere la funzione all’enzima.
