genetyka artykul 2 Flashcards
ori -
znaczenie w nauce
funkcje
- w tym miejscu następuje inicjacja procesu replikacji plazmidu.
!!! Sekwencja ori ogranicza namnażanie plazmidu do jednego gatunku bakterii gospodarza.
restryktazy
znaczenie w nauce
funkcje
Endonukleazy restrykcyjne są rodziną bakteryjnych białek enzymatycznych, które potrafią ciąć DNA tylko w miejscach o ściśle ustalonej sekwencji nukleotydowej.
- forma obrony bakterii przed obcym DNA. Genom bakterii albo NIE zawiera miejsc rozpoznawanych przez produkowane przez nie enzymy restrykcyjne, albo chroni je przed cięciem, na przykład dzięki metylacji nukleotydów.
W technikach molekularnych:
- precyzyjne odcięcie interesującego fragmentu DNA
Miejsca restrykcyjne
pochodzenie enzymow - ecoRI, ecoRV
- noszą nazwy identyczne jak enzymy, które je rozpoznają.
Nazwy enzymów pochodzą od gatunków bakterii je produkujących.
- Enzymy EcoRI i EcoRV to jedne z pierwszych oczyszczonych z E. coli;
- MspI pochodzi z Micrococcus species a TaqI z Termophilus aquaticus.
Region plazmidu bogaty w miejsca restrykcyjne jest wykorzystywany w plazmidach do wbudowania obcego fragmentu DNA, czyli INSERTU. Miejsce to bywa często nazywane MIEJSCEM KLONOWANIA. (?!)
gen selekcji
funkcje
(+odpornosc na antybiotyki w nauce)
- powoduje, że bakterie, w których plazmid się replikuje, są “zainteresowane” jego utrzymaniem.
Spośród kilku stosowanych genów oporności na antybiotyki najczęściej wykorzystywany jest:
- gen beta-laktamazy, warunkujący oporność na penicyliny
- gen fosfotransferazy aminoglikozydowej, warunkującej oporność na aminoglikozydy
- gen acetylotransferazy chloramfenikolu.
Jeśli do podłoża hodowlanego był dodany jeden z wymienionych antybiotyków, to w wyniku selekcji przeżyją tylko te bakterie, które mają plazmidy z odpowiednim genem oporności. Antybiotyk powoduje dodatkową amplifikację, czyli zwiększenie liczby kopii plazmidu w bakterii.
niezbedne elementy do klonowania w plazmidach
ori, miejsca restrykcyjne, gen selekcji
sztuczne chromosomy
mają niewielką cząsteczkę (około 10 000 par zasad). Wyposażono je jednak w mechanizm, który po linearyzacji DNA i wbudowaniu insertu, a następnie transfekcji gospodarza podtrzymuje liniowy kształt cząsteczki. => replikacja, zazwyczaj bez szczególnej amplifikacji liczby kopii, ale za to wraz z kilkuset tysiącami nukleotydów pochodzących z genomu człowieka.
Wariant bakteryjny wektora (bacterial artificial chromosome - BAC)
sztuczny chromosom drożdży (yeast artificial chromosome - YAC)
służą lokalizacji nowych genów i poszukiwaniu nowych sond DNA
*YAC, badania ekspresji genów i białkek mające wpływ na jej regulację, ponieważ w toku ewolucji zachowane zostało znaczne podobieństwo czynników kontrolujących transkrypcję u wszystkich Eucaryota.
sekwencjonowanie (+znaczenie klonowania)
enzym
*w oparciu o reakcję enzymatyczną.
Klonowanie= uzyskanie dostatecznie dużej liczby identycznych cząsteczek, które są następnie w przebiegu sekwencjonowania kopiowane in vitro.
W procesie tym wykorzystany jest enzym pochodzący z bakteriofaga - polimeraza T7. Kopiowanie dotyczy tylko jednej nici, ponieważ wykorzystywany jest tylko jeden starter zbudowany z około dwudziestu nukleotydów (oligonukleotyd).
Starter
= oligonukleotyd zbudowany z 6 do 40 zasad nukleotydowych, sekwencja jest komplementarna w stosunku do badanej matrycy DNA lub RNA.
Startery o długości ponad 18 nukleotydów w sposób wybiórczy mogą hybrydyzować z sekwencją komplementarną, jeśli nawet pojedyncze kopie matrycy zmieszane są z milionami innych cząsteczek DNA. Koniec 3’ przyłączonego startera wyznacza początek replikacji DNA.
sekwencjonowanie przez trifosforany deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP)
Dideoksynukleotydy są pozbawione grupy hydroksylowej w pozycji 3’ deoksyrybozy. Ich złudne podobieństwo pełni rolę ślepej uliczki, uniemożliwiając dalszą syntezę nici. => zatrzymanie wydłużania łańcucha nukleotydowego następuje zawsze w pozycji zajmowanej przez ten sam dideoksynukleotyd.
mutacja konserwatywnej
mutacja cicha
K = mutacja, która nie wywołuje zmiany sekwencji polipeptydu. C = zamiana aminokwasu spowodowana mutacją punktową, nie wpływa na zmianę właściwości białka.
Cichy allel zawiera natomiast taką mutację, która prowadzi do utraty własności katalitycznej białka..
Niedokrwistosc sierpowatokrwinkowa
Przyczyna: zamiana A=>T w 6 kodonie genu beta-globiny (GLN=>VAL). Mutacja Glu6Val lub E6V(!)
/ agregacja hemoglobiny, co pociąga za sobą zmianę kształtu krwinek, hemolizę i zatorowość
rec kodom
klonowanie funkcjonalne
klasyczna metoda poszukiwania genów na podstawie ich produktów białkowych
genetyka odwrotna
klonowanie pozycyjne
punktem wyjścia jest chromosomowa lokalizacja genu (klonowanie pozycyjne). Metoda ta jest jedyną możliwą w przypadku defektu genetycznego, dla którego nie jest znane nieprawidłowe białko (a tym samym nie jest znany mechanizm molekularny choroby). Niezbędnym warunkiem odkrycia genu takiej choroby jest znalezienie rodzin, w których zaburzenie genetyczne wystąpiło u kilku jej członków.
Dystrofia mięśniowa Duchenne’a
=zanik włókien mięśni szkieletowych, często z rzekomym powiększeniem mięśni spowodowanym przerostem tkanki tłuszczowej
= u chłopców, sprzężony z chromosomem X (reces)
przyczyna: defekt/ubytek; w przypadku delecji dotknięty jest zawsze prążek 21 na ramieniu krótkim chromosomu X (Xp21).
