DNA recombinante Flashcards
¿Qué es el DNA recombinante?
Secuencias de DNA derivadas de más de una fuente
¿Qué son las enzimas de restricción?
Son un mecanismo de defensa de las bacterias frente a la entrada de DNA foráneo
-> corta el vector de DNA y el inserto de DNA en sitios específicos para permitir la ligación
¿Qué hacen las enzimas de restricción? (2)
-Degradan el DNA extraño
-No degradan el DNA propio de la bacteria
¿De qué se encargan las enzimas de restricción?
Monitorean el DNA que entra a la célula y lo destruyen si lo reconocen como malo
Son las que degradan el DNA extraño, reconocen una secuencia y cortan el DNA
Endonucleasas
E. Coli tiene sus propias enzimas de restricción
las pseudomonas y cada bacteria tiene sus propias enzimas
- 1º.- primera letra del género de la bacteria (escherichia)
- 2 y 3º.- nombre de la especie (coli)
4ta letra es la cepa (RY13)
-> Número romanos: de acuerdo a conforme se fueron encontrando
Es un sistema de defensa natural de las bacterias.
Enzimas de restricción
Tipos de enzimas de restricción
Endonucleasas
Enzimas del sistema de modificación
Caract. de las enzimas del sistema de modificación
Metilasas: modificar el ADN propio para que no sea degradado -> El ADN metilado es inmune, sino sería degradado.
Modifican el DNA propio para que no sea degradado
Metilasas
Tipo I de enzimas de restricción caract.
Reconoce que debe de cortar -> es asimétrico
el sitio de corte es lejos del sitio de reconocimiento,
1000 pares de bases
Enzima de restricción Tipo II caract.
-Reconoce el sitio y ahí mismo hace el corte
-Son secuencias palindrómicas -> se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos (ADN o ARN) que posee simetría al leerse igual en ambas direcciones
El sitio de reconocimiento es igual al sitio de corte ¿De qué tipo de enzima de restricción estamos hablando?
Tipo II
Enzima de restricción Tipo III caract.
Reconoce el sitio pero corta 20 -30 pares de bases de distancia en relación con la secuencia -> son asimétricos
Enzima de restricción Tipo IV caract.
Reconoce DNA metilado
¿Qué tipo de enzima de restricción usaríamos en lab y por qué?
Tipo II -> porque es específica, si queremos cortar un gen lo queremos cortar ahí mismo, no 1000 pares de bases para allá
¿Qué hacen las endonucleasas? (2)
1- Cortan enlaces fosfodiéster del DNA en secuencias específicas
2- Reconocen secuencias palindrómicas
-> producidas por las bacterias las endo
Tipos de cortes de las enzimas de restricción (2)
Cohesivos
Romos
¿Cómo son los cortes cohesivos?
Son asimétricos
Cortes en diferente posición
3 a 5 nt de diferencia
¿Cómo son los cortes romos?
Cortes simétricos en ambas cadenas
Es una pequeña molécula de ADN circular distinta del ADN cromosómico que posee la capacidad única de replicarse de forma independiente duda?
Plásmido -> este se le pone a la bacteria, vamos a tener varios fragmentos mediante ligasa para unir enlaces fosfodiéster y tenemos el plásmido combinado (DNA recombinante) -> este se le pone a la bacteria
Para que mi plásmido funcione como vector debe tener
ori, gen de resistencia antibiótica y una región palindrómica
Molécula dsDNA con capacidad de albergar un fragmento de DNA exógeno
Vector -> Ej: plásmido y bacteriófagos
Tipos de vectores (2)
Clonación y Expresión (genera proteína)
¿Qué nos permite la clonación?
Viene de una misma célula
Nos permite almacenar secuencias y obtener grandes cantidades de DNA
¿Qué permite la expresión?
Producir un transcrito o proteína -> debe generar una proteína
En la clonación que ocupamos?
-Plásmido ocupa un punto de origen (prok solo tiene uno) -> para poder separar las hebras y se replica
-Sitio múltiple de clonación (secuencias palindrómicas)
-Marcador de selección
¿Qué es el sitio múltiple de clonación?
Es donde están secuencias palindrómicas -> para poder cortar con enzimas de restricción
-> Va a ser una secuencia especifica que es reconocida
por las enzimas de restricción para poder insertar el DNA complementario
Características de los marcadores o marcaje de selección
-Podemos poner gen que le de resistencia a un antibiótico a mi bacteria
-Podemos poner un gen para que se ponga de un color diferente la bacteria
-O ponerle una enzima para que mi bacteria pueda tomar alimento (β-galactosidasa)
-> dependiendo del marcaje que yo le ponga voy a modificarla,
Cuando la bacteria agarre mi plásmido va a tener el gen que tu quieres y el gen de resistencia a la penicilina, ponemos medio de cultivo que tenga penicilina para que todas esas bacterias que no agarraron tu plásmido se mueran Entender
En la práctica tenemos marcaje de selección que es resistencia al antibiótico -> ponemos medio de cultivo, ponemos plásmido - lo pasamos a una placa que tiene un antibiótico - si el plásmido tuvo un gen de resistencia a una penicilina y nosotros ponemos medio de cultivo que tenga penicilina - a las bacterias que no tienen su gen se mueren -> todas aquellas bacterias que no tiene el gen del marcaje se petatean -> y así sabemos que la bacteria ya tiene su plásmido
Todo plásmido que tiene (3)
Punto de origen (separa hebras)
Sitio múltiple de clonación (palindromicas)
Marcador de selección
En la expresión qué ocupamos
Punto ori para separar hebras
Sitio múltiple de clonación dónde están las secuencias palindrómicas
Marcador de selección para ver si tiene plásmidos
Promotor (NO ES TATA) -> para realizar transcripción
RNAm ocupa CAP y poliA -> al ser bacteria no tiene CAP
tiene sitio de unión a ribosoma para que se pueda traducir y tiene secuencia de poliA
Características de los plásmidos (3)
dsDNA
Circulares
Separados del DNA cromosómico
Son virus que infectan a las bacterias
Bacteriófagos
Plásmido y bacteriófago diferencias
Plásmido es pequeño, metemos genes más pequeños.
Los bacteriófagos nos permite mayor cantidad de nt
-> SI tenemos pedazo de gen grande lo puedo usar con un bacteriófago
¿Qué hacen los bacteriófagos cuando se modifican genéticamente?
Eliminan genes que no se requieren para la replicación y empaquetamiento
-> modificamos genéticamente el gen (DNA) del bacteriófago y lo introducimos nuevamente
Son vectores híbridos
Cósmidos
Cósmidos caract
Alberga gen más grande: agarramos plásmido, ponemos gen muy grande -> al no poderse enrollar le ponemos pequeños fragmentos que vienen del bacteriófago (sitios cos) -> permiten que se vuelva a doblar o empaquetar el DNA y ya puede entrar en la cabecita del bacteriófago
sitios cos qué permite?
Permiten que se vuelva a doblar o empaquetar el DNA y ya puede entrar en la cabecita del bacteriófago
Fagémidos caract.
Plásmido al que se le incorpora el origen de replicación de un fago (que sea totalmente lineal , gen más grande y buscamos bacteriófago que pueda albergar este tamaño de gen
No tienen sitios cos
Cromosomas artificiales
BAC -> agarramos DNA cromosómico, se lo quitamos a la bacteria, lo modificamos para que solo tenga el gen que yo quiero -> y lo volvemos a poner a la bacteria
YAC -> usamos levadura (cel euk) quitamos DNA, lo modificamos y se lo volvemos a insertar y la levadura hace lo que nosotros queramos
Molécula de DNA circular utilizado para la replicación y expresión de un gen clonado en estudios de ADN recombinante
Plásmidos
Tipo de vector que combina las propiedades de un plásmido y un fago, permitiendo la eficiencia de un vector de fago con la versatilidad y facilidad de uso de un plásmido
Cósmido
Tipo de vector que incluye un origen de la replicación, un sitio múltiple de clonación y un marcador de selección
Clonación
Proceso utilizado para identificar células que han sido transformadas exitosamente con DNA recombinante
Selección
Tipo de vector utilizado específicamente para la producción de proteínas en un organismo huésped
Expresión
Método utilizado para separar moléculas de DNA recombinante de acuerdo a su tamaño mediante un campo eléctrico
Electroforesis
