Análisis de ac. nucleicos Flashcards
Es el primer paso para los estudios de biología molecular y para las técnicas de DNA recombinante, secuenciación, mutagénesis.
Extracción del DNA -> medicina forense, nanotecnología de DNA
¿De qué depende la elección del método de extracción del DNA?
Del tipo de ác. nucleico que se va a extraer, del organismo de origen de esos ác. nucleicos (prok, plantas, virus), de la fuente del ác. nucleico (sangre, suero, orina, LCR) y de la técnica en que se utilizará el ac. nucleico extraído
Menciona algunas fuentes de ácido nucleico
Sangre, suero, plasma, biopsia, orina, LCR, raspado bucal, LA, folículo capilar, etcétera
Pasos para la extracción del DNA
-Lisis de las células y liberación del DNA
-Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos
-Precipitación de DNA
Sal salina saturada -> desnaturaliza proteínas
-Lavado de DNA con agua
Estudio que mide la cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una solución muestra
Espectrofotometría -> Mide la longitud de onda y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra.
Mientras más luz absorba menos concentración. V o F
FALSO -> Mientras mas luz absorba mayor concentración
DNA y RNA absorción: 260nm
Proteínas: 280nm
Fenol: 270
Unión específica de colorantes fluorescentes al ácido nucleico
Fluorometría
¿Qué es la fluorometría?
Unión específica de colorantes fluorescentes al ácido nucleico
Absorbe la luz a una determinada longitud de onda y emite una longitud de onda superior.
La concentración es proporciona a la intensidad de emisión fluorescente
Colorante utilizado en fluorometría
Hoechst 33258
¿Qué son las pruebas de PCR?
Reacción en cadena de la polimerasa son una forma rápida y muy precisa de diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas y cambios genéticos. Las pruebas detectan el ADN o el ARN de un patógeno
¿Qué se necesita para realizar una PCR?
-Secuencia de DNA
-Enzima DNA polimerasa
-Desoxiribonucleotidos (dNTP)
-Primers -> se colocan ya hechos
Es el fragmento de DNA que contiene el gen a buscar
DNA templete
Usamos proteína de esta bacteria para aguantar temperatura del termociclador
Thermus aquaticus (Taq)
Principal enzima que se utiliza para amplificar secuencias del genoma humano
Taq polimerasa
Función del cloruro de magnesio
Es cofactor de la Taq polimerasa
Características que deben tener los primers
-Son diseñados por el investigador, buscando que sea complementario a la secuencia buscada
-Son cortos y proporcionan extremo 3´
-Alto contenido en C y G (3 puentes de H+)
Es una solución amortiguadora necesaria para que la Taq polimerasa haga su función
Buffer / Cofactor
Fases de la PCR (3)
Desnaturalización
Hibridación
Extensión o Elongación
¿Qué ocurre en la desnaturalización?
-Se separan las cadenas DNA a 95ºC (20 a 30 seg)
-Se rompen puentes de H+
¿Qué ocurre en la hibridación?
Fase donde los primers se alinean al extremo 3´ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria
-> Tm 50°C a 60°C (temp de alineamiento del termociclador)
¿De qué depende la temperatura en la fase de hibridación?
Depende de los primers
Fórmula para estimar la temperatura melting o de hibridación
Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)
¿Qué ocurre en la extensión?
Fase en la que la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza a agregar dNTP´s complementarios para crear las cadenas completas de DNA
Fase en la que Taq polimerasa pone nt
Extensión
Temperatura óptima para la reacción de extensión
72ºC
¿Cuántas ciclos tiene una PCR?
de 30 a 40 ciclos
1er ciclo con un cadena de DNA tengo 2
4 ciclos = 8 DNA
Multiplicar por 2
¿Qué hacemos al final de la PCR?
Se realiza un gel de electroforesis
¿Qué es la electroforesis?
Técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico
¿Qué se necesita para la electroforesis?
qué genera
Cámara de electroforesis
Genera campo eléctrico alrededor de un gel
La cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía
¿Para qué sirve la corriente eléctrica en la electroforesis?
Para mover las moléculas y que se separen a través de un gel
¿Qué función tienen los poros del gel?
Actúan como un colador, permitiendo que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las grandes
Función del gel de agarosa
Se usa para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas
Es un polisacárido extraído de algas marinas
Gel de agarosa -> separar fragmentos de DNA, que van de 100 pb a 25 kb
-Genera poros
Caract. de los poros
-El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada
-La concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido
Caract. de RPC estándar
Amplificación de un segmento de DNA utilizando dos partidores -> se detecta la amplificación es mediante geles de agarosa
Aplicación del RPC estándar
Detección cualitativa de un segmento de DNA, si lo tiene o no
Caract. de RCP múltiple
Amplificación de 2 o más segmentos de DNA utilizando varios partidores en una sola reacción de amplificación
Aplicaciones de RCP múltiple o multiplex
Detección cualitativa de varios segmentos de DNA en una sola reacción de RPC -> dif virus o segmentos en una sola muestra
Caract. de RPC-RFLP (Restriction fragment length polymorphisms)
RPC estándar con paso posterior de digestión con enzimas de restricción
Se usa en la detección de polimorfismos genéticos (SNPs)
RPC-RFLP
Caract. de la RT (Reverse transcriptase) -RPC
Síntesis de cDNA a partir de RNA mediante transcripción reversa, seguido de una RPC
Se utiliza esta PCR para detección de virus RNA
La RT - RPC -> al hacer transcriptasa reversa podemos detectar RNA
Caract. de RPC - TR (Real time) qPCR
-Es CUANTITATIVA
-PCR estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluróforos para la detección de los fragmentos amplificados
-Cambian los primers y polimerasa, no podemos esperar productos tan grandes (40-60 pares de bases)
Aplicaciones del RPC-TR (Real time)
-Detección cualitativa de uno o varios segmentos de DNA
-Cuantificación de DNA en la muestra (cargas) o expresión de genes (asociada a una reacción de transcripción reversa)
-Para ver cuánto virus, RNAm tenemos
Qué prueba usar de PCR si mi paciente tiene UN solo virus y ¿por qué?
-PCR en tiempo real pues es más sensible para pequeñas cantidades
-Ideal para hacer diagnóstico -> método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos
¿Qué es una sonda fluorescente?
Secuencia de nucleótidos del gen de interés
dar vuelta a flash y aprender
La sonda es secuencia de nt adentro del gen
Hago secuencia de nt que la pueda complementar
A la hora de hacer la PCR, tengo primers y la sonda que diseñé que se complementa a esa gen
Le pongo fluoroforo e inhibidor del mismo -> no quiero que se encienda, al estar unidos está inhibido
Cuando sea la temp de alineamiento se va a pegar los primers y la sonda
En la temp de extensión se van agregando nt; hasta que llega a donde está la sonda y lo que hace es quitar la sonda y sigue poniendo nt, el fluroforo se activa y manda señal que detecta la computadora
En una reacción de qPCR, a medida que los cebadores y la ADN polimerasa duplican la cadena molde, ¿Qué ocurre?
SYBR Green se une al ADN de doble cadena a medida que se forma.
