DESGRANULAÇÃO E CITOTOXICIDADE

Question 1

Citotoxicidade mediada por células NK contra células tumorais

Answer 1

• reconhecimento, efetor, terminacao

Question 2

PROCEDIMENTO 1

Answer 2

• monensina
• tubo apenas com NK vai medir desgranulacao espontanea
• adicionar Ig anti cd3 e cd56
  nos tubos
• pbmc (cels mono sangue periferico)
• meio de cultura
• Ig anti 107da
• monensina
• anti cd3 e 56
• no B K562, linha cels tumorais

aquisicao de dados
- PMBC, no grafico y(complexidade) e x(tamanho) temos linfocitos e monocitos
- gate de linfocitos, separamos cd3 e cd56, seprando NK 56+ e 3-
- gate de cels NK, separamos cd107a + e -, as (+) estao a desgranular
- formula p percentagem de desgranulacao Nk, slide 11
(B-A/100-A)
(pode estar alterado patologia)
- 26% significa que é essa a percentagem de desgranulacao das NK

Question 3

Reconhecimento pelas células NK

Answer 3

tolerancia
- + sinais inibitorios
- cel expressa MHC I, ligando do KIR (inibitorio) e outro nos recetores NKG2, o A tem um ligando inibitorio e o D um estimulador
- nao ha ataque das NK
- cel self

induced self
- KIR mantem ligando MHC 1 (inibitorio)
- ambos recetor NKG2 com sinais estimuladores
- provavelmente uma cel do self que expressa ptn de stress, em casos como infecoes virais etc
- ha ataque cels NK

missing self
- ausencia de inibicao (cel nem expressa MHC 1)
- so tem sinal estimulador
- cel tumorais, pe
- cel NK vai atacar

(no ataque da NK, ocorre lise citotoxica com libertacao de citocinas, granzinas, perforinas)

Question 4

Avaliacao da morte cel mediada por NK

Answer 4

CEL ALVO
(podemos avaliar todos os passos dos eventos que ocorrem…)
- entrada gran B
- ativ caspasaes
- permeabilizacao membrana plasma
- libertacao de citocinas, quimiocinas, cromio …

CEL NK
(processo de desgranulacao)
- cel c granulos c granzina e perforina
- fundem se c membrana ( esta transforma se p n sofrer c essas mm molec q induzem apoptose- lipic shielf)
- perforina forma poros cel alvo e gran B entra, induzindo apoptose cel alvo

Question 5

Desgranulação das células NK medida pela expressão de CD107a/b

Answer 5

• parede dos granulos com CD107a
• quando granulos fundem com memb cel, este rececor passa a pertencer memb cel
• Ig anti cd107a, ao identificar numa memb NK, indica que o NK ja iniciou processo de desgranulacao
• se NK em repouso, NK n os vai exprimir a superficie

Question 6

MONENSINA

Answer 6

• inibidor do transporte do complexo de Golgi
• quando ocorre fusao dos granulos com membrana, estas nao internalizarem os recetores
  (transporte do CD107a impossibilitado de “voltar p tras” e ser internalizado)

Question 7

PROCEDIMENTO 2

Answer 7

• CFSE marca cels tumorais e PI marca morte celular (as que estao em apoptose)
• PI so entra na cel se membrana comprometida
  nos tubos
• K562 (linha celular tumoral)
• CFSE
• PI
• no D, metemos PBMC (p adicionar cels NK)

tubo so com cel tumorais sem nk
- cels so com CFSE sem PI porque nao estao em apoptose
- da nos morte espontanea

tubo com cels tumorais e nk
- nk liberta perforina, granzina entra, pormove apoptose
- PI entra na cel
- da nos morte cels tumorais em contacto c NK

AQUISICAO DE DADOS
- no grafico tamanho complexidade, temos pbmc e depois K562
- gate k562, todas+ p CFSE e separamos por PI (+ ou-, as + estao em apoptose)
- formula (D-C/100-C)

Question 8

EXTRAS

Answer 8

outras cels c capacidade citotoxica
- cd8
- nl
- tcr gama delta

medir atividade citotoxica destas cels
- dot plot cd3 e Ig anti tcr gama delta
- cd3 + (apenas), outras sao + p os dois (pegamos nestas)
- noutro gate viamos se havia desgranulacao nestas

OU SEJA
- na citometria podemos decidir que cels e que parametros queremos avaliar

se quisermos ver producao interferao gama
- esta no sobrenadante
- se inibirmos o transporte de golgi, o que e prod dentro da cel deixa de vir p fora
- interferao gama produzido fica dentro da celam
- se permeabilizarmos membrana p Ig anti interferao entrar, podemos depois comparar cels q estao a desgranular e as que nao estao e comparar producao interferoa

porque e que 70% nk nao desgranulam quando estao em contacto com NK
- cels n tem reportorio igual
- mts nk podem nao ter recetores ativadores, n reconhecendo cels tumurais e nao atacam
- alg cels tumorais podem ser mais resistentes a lise citotoxica